Головна
Банківська справа  |  БЖД  |  Біографії  |  Біологія  |  Біохімія  |  Ботаніка та с/г  |  Будівництво  |  Військова кафедра  |  Географія  |  Геологія  |  Екологія  |  Економіка  |  Етика  |  Журналістика  |  Історія техніки  |  Історія  |  Комунікації  |  Кулінарія  |  Культурологія  |  Література  |  Маркетинг  |  Математика  |  Медицина  |  Менеджмент  |  Мистецтво  |  Моделювання  |  Музика  |  Наука і техніка  |  Педагогіка  |  Підприємництво  |  Політекономія  |  Промисловість  |  Психологія, педагогіка  |  Психологія  |  Радіоелектроніка  |  Реклама  |  Релігія  |  Різне  |  Сексологія  |  Соціологія  |  Спорт  |  Технологія  |  Транспорт  |  Фізика  |  Філософія  |  Фінанси  |  Фінансові науки  |  Хімія

Секвенування (Генна інженерія) - Біологія

ЗМІСТ

Введення ...3

1. Визначення нуклеотидної послідовності модифікованим методом Максама і Гілберта ...4

2. Секвенирование ДНК методом полімеразного копіювання (метод Сенгера) ... 8

3. Філогенетичний аналіз геномів вірусів ... 15

4. Комп'ютерний аналіз генетичних текстів ... ..18

Висновок ... ..22

Список літератури ... .23

ВСТУП.

Розробка методів клонування і визначення послідовності підстав (секвенування) нуклеїнових кислот поклала початок новому етапу розвитку молекулярної біології. Знання первинної структури ділянок геному, виконують певні функції, дало можливість ефективно застосувати для їх дослідження цілий арсенал нових методів генної інженерії. Ці методи (спрямований мутагенез, рекомбінація in vitro та ін.) Дозволяють модифікувати ділянки нуклеотидних послідовностей і досліджувати їх функції на молекулярному рівні. З їх допомогою комбінуються ділянки генетичного матеріалу і створюються геноми з абсолютно новими функціями.

Секвенування нуклеїнових кислот в даний час стало рутинним методом молекулярної біології. Безсумнівно, в найближчому майбутньому з'являться ще більш досконалі автоматичні секвенатори, що призведе до різкого збільшення числа розшифрованих послідовностей.

Завдяки знанню генетичного коду з'явилася можливість визначати ділянки нуклеотидних послідовностей, які кодують потенційні білки. Це джерело і сьогодні дає нам основну інформацію про функціональний будові нуклеотидноїпослідовності.

1. ВИЗНАЧЕННЯ нуклеотидну послідовність модифікований метод МАКСАМА І Гілберт.

Швидкий прогрес, що спостерігався в останні роки в різних областях молекулярної біології, багато в чому обумовлений появою ефективного методу визначення первинної структури ДНК. Цей метод, запропонований в 1977 р Максамом і Гилбертом, заснований на селективної хімічної модифікації різних типів гетероциклічних основ у складі ДНК з наступним розщепленням межнуклеотидной зв'язків в модифікованих ланках. Реакції селективної модифікації по кожному типу гетероциклічних підстав проводяться таким чином, щоб у кожній молекулі ДНК в середньому модифікувався тільки одна ланка даного типу. Оскільки всі ланки даного типу в складі молекули еквівалентні і реагують з модифицирующим агентом з однаковими швидкостями, то в сумі кожна ланка цього типу виявиться частково модифікованим. Подальша обробка ДНК вторинним аміном або лугом приводить до відщеплення модифікованих гетероциклічних підстав від ланцюга ДНК і розриву полінуклеотидних ланцюга в місцях відщеплення гетероциклов (рис. 1).

Модифікації піддають ДНК, 32Р-мічені по 5'-кінцевому нуклеотидному ланці. Радіоактивна мітка вводиться фосфорилюванням за допомогою-32Р-АТР і Т4-полінуклеотідкінази. Таким чином, в результаті хімічної деградації виходить набір фрагментів ДНК різної довжини. Довжини цих фрагментів відповідають положенню мономірних ланок того типу, який піддавався модифікації. Кінцева радіоактивна мітка служить точкою відліку при визначенні довжини продуктів хімічної деградації ДНК (рис. 2)

Набір отриманих фрагментів фракціоніруется електрофорезом в ПААГ, який дозволяє розділяти оліго (поли) нуклеотиди, що відрізняються по довжині всього на одне мономерна ланка. Послідовність нуклеотидів в ДНК читається безпосередньо з радіоавтографа гелю.

Метод Максама і Гілберта, розроблений для аналізу первинної структури досить довгих ДНК, застосовний і для коротких (8 - 16 ланкових) олі-годезоксірібонуклеотідов. Однак у цьому випадку реакції хімічної модифікації проводять у більш жорстких умовах (збільшуючи час і температуру реакції) з метою підвищення ступеня модифікації.

Малюнок 1.1 Відщеплення модифікованих ланок від ланцюга ДНК після обробки вторинним аміном або лугом.

Малюнок 2 Хімічна деградація ДНК.

Набір реакцій, що застосовуються для розщеплення ДНК по мономірним ланкам певного типу досить великий і постійно поповнюється: за залишками гуаніну - обробка диметилсульфатом (рис. 3); по залишках аденіну та гуаніну - апурінізація 50% -ної мурашиної кислотою (по Бартону); по залишках аденіну і цитозину - розщеплення гетероциклічних підстав під дією 1,2 н. гідроксиду натрію і по залишках тимідину і цитозину - обробка гидразином (рис. 4).

В даний час широко використовуються два основні варіанти секвенування по Максаму - Гілберту. У першому з них реакції хімічної модифікації ДНК проводять у розчині, а в другому ДНК попередньо иммобилизуют на твердій фазі (наприклад, ДЕАЕ-целюлозі). Перший метод більш традиційний, його численні модифікації з успіхом використовувалися для секвенування фрагментів ДНК різних розмірів, в тому числі олігонуклеотидів. У той же час другий метод має ряд переваг. Він менш трудомісткий і займає менше часу, простіше в освоєнні, дозволяє обійтися мінімальним набором устаткування. В цілому обидва методи забезпечують отримання цілком прийнятних результатів, а вибір одного з них визначається конкретними умовами лабораторії.

Малюнок 3 Реакція селективного розщеплення залишками гуаніну

Малюнок 4 Реакція селективного розщеплення залишками тимідину і цитозину.

2. секвенування ДНК методом полімеразної КОПІЮВАННЯ.

(МЕТОД Сенгер)

Ферментативний синтез оліго (поли) дезоксірібонуклеотідов за допомогою ДНК-полімерази, що полягає в копіюванні матричного полинуклеотида знайшов блискуче застосування в якості одного з двох найбільш ефективних методів встановлення первинної структури ДНК. Метод полягає в отриманні блоків-копій полідезоксірібонуклеотіда, структура якого вивчається. При цьому обов'язковим є виконання двох умов. По-перше, копіювання повинно проводитися, починаючи з певного мономерного ланки. По-друге, синтез копій слід здійснювати чотири рази, кожен раз зупиняючи його по черзі на якомусь одному з чотирьох мономёрних ланок (A, G, С або Т), інакше кажучи, прагнуть отримати повний набір "комплементаціонно відображених" копій досліджуваного полинуклеотида, утворення яких припинилося у кожному з місць розташування одного з чотирьох мономірних ланок нуклеїнової кислоти. Визначення довжини кожної копії дозволяє встановити становище даного мономерного ланки у ланцюгу досліджуваного полинуклеотида. Довжина копії визначається фракціонування в поліакриламідному гелі. Цей метод, таким чином, так само як і метод, заснований на модифікації підстав дозволяє отримувати інформацію про становище певного мономерного ланки у ланцюгу полинуклеотида прямо після фракціонування.

Для отримання копії досліджуваного полинуклеотида в останньому вибирають точку відліку, що досягається введенням в систему ферментативного синтезу як нуклеозидного компонента олигонуклеотида-затравки. Такий олигонуклеотид у всіх копіях, що утворюються в результаті добудовування його ферментативним шляхом, залишається постійним 5'-кінцевим фрагментом, т. Е. Є точкою відліку. Копіювання за допомогою ДНК-полімерази в присутності всіх чотирьох дезоксирибонуклеозид-5'-пірофосфатів (один з них берется32Р-міченим) проводять протягом обмеженого часу. Мета цього етапу - проведення статистично обмеженого синтезу для отримання всіх можливих копій, починаючи з затравки, добудованої на одне, два і т. Д. Ланок, і включаючи повну копію досліджуваного полинуклеотида. В ідеалі суміш повинна включати всі можливі полінуклеотіди (рис. 5), синтез яких статистично припиняється десь в середині матричного полинуклеотида в районі ATGCTG матричної послідовності. На практиці різні компоненти суміші присутні в різних кількостях. Якщо таку суміш далі піддати електрофорезу в поліакриламідному гелі в певних умовах, коли швидкість руху пропорційна довжині ланцюга, на електрофореграмме виявляється серія смуг, що представляють різні олігонуклеотиди. Таке фракціонування звичайно не проводять, хоча воно може використовуватися для контролю на

Малюнок 5 Використання ферментативного синтезу оліго (поли) дезоксірібонуклеотідов для визначення первинної структури ДНК.

завершальному етапі аналізу. Инкубационную смесь32Р-мічених олігонуклеотидів різної довжини у вигляді комплексів з матричним полінуклеотидом піддають гель-фільтрації для видалення дезоксирибонуклеозид-5'-трифосфату і аліквоти реакційної суміші реінкубіруют з ДНК-полімеразою в різних умовах. У випадку "мінус-системи" реінкубацію проводять у присутності лише трьох дезоксирибонуклеозид-5'-три-фосфатів. Наприклад, в «- А-системі» відсутня dATP і кожна копія в суміші добудовується за допомогою ДНК-полімерази до місця, в якому наступним мономірним ланкою повинен бути залишок pdA (тобто Т в матричному полинуклеотиде). Образующуюся суміш фракционируют за допомогою електрофорезу і виявляють (ауторадіографіческі) обмежена кількість смуг (їх кількість дорівнює кількості Т в матричному полинуклеотиде). Аналогічно проводять копіювання за відсутності інших субстратів: - dGTP, - dCTP або - dTTP (- G -, - С- і - Т-системи відповідно). Всі чотири ионофореза проводять у поліакриламідному гелі паралельно. Отримані ауторадіограмми дозволяють відразу написати нуклеотидну послідовність, причому читання ланцюга знизу вгору відповідає 5'3'-полярності ланцюга копії. Наприклад, положення самого короткого олигонуклеотида (в "- Т-системі") вказує на те, що наступний за ним по довжині олигонуклеотид закінчується на Т, т. Е. Що проти смуги, розташованої вище (це смуга в - А-системі), слід записати букву Т. Таким же чином записують далі в послідовності букву А (на підставі положення наступного за довжиною олигонуклеотида, який опинився в "- А-системі") і т. д. Відповідний ділянку ланцюга в матриці читається з урахуванням принципу комплементарності і антипаралельності ланцюгів в комплексі матриця - запал. Для перевірки цих даних використовують результати аналізу за допомогою "плюс-системи". У цьому випадку додаткове копіювання (після першого етапу) проводять у присутності ДНК-полімерази, виділеної з бактеріофага Т4, що у відсутність субстратів (нуклеозид-5'-трифосфату) проявляє 3'-екзонуклеазную активність (аналогічну дії ФДЕ зміїної отрути), т. е. отщепляет мононуклеотиди один за іншим з 3'-кінця. У той же час у присутності субстратів її полімеразна активність у багато разів перевершує екзонуклеазную. Так, якщо в реакційній суміші присутній хоча б один дезоксирибонуклеозид-5'-трифосфат (dATP в "+ А-системі"), деградація кожної копії, що утворилася на першій стадії аналізу, проходитиме аж до місця положення А (Т в матриці). У цьому випадку pdA включається багато швидше, ніж видаляється, і, таким чином, накопичуються фрагменти, що містять на 3'-кінці ланцюга А. Аналогічно проводять копіювання в присутності лише dGTP, dCTP або dTTP. Суміші паралельно піддають електрофорезу, як і в попередньому випадку, і отримують ауторадіограмми, з яких відразу зчитується послідовність 5'3'-напрямок, зчитується також знизу вгору). З порівняння фореграмме "плюс-" і "мінус-систем" робиться однозначний висновок про нуклеотидної послідовності в копіях і, отже, в матричному полинуклеотиде.

В даний час виділення фрагментів ДНК, створення рекомбінантних генів, а так само пряме секвенування ДНК і кДНК стають загальнодоступними методами завдяки широкому впровадженню ПЛР (полімеразної ланцюгової реакції) .Сущность ПЛР полягає у використанні двох олігонуклеотидів-праймерів, здатних специфічно гібрідізоваться з послідовностями нуклеотидів на протилежних кінцях двох ланцюгів ділянки ДНК, в якості затравки для одночасного синтезу комплементарних ланцюгів з протилежних кінців матриці за допомогою термостабільної ДНК-полімерази. У ході повторюваних циклів (температурної денатурації ДНК, відпалу і ензиматичною добудови праймерів) експоненціально збільшується кількість дискретного фрагмента, фланкували послідовностями нуклеотидів, соответсвующих первинної структурі праймерів.

Застосовність методу Сенгера залежить від можливості отримання одноланцюгових копій клонованих ДНК. Для цієї мети можна використовувати вектори на основі бактеріофага М13. Двухцепочечную чужорідну ДНК можна клонувати в двухцепочечной репликативной формі (РФ) фагової ДНК, при цьому після трансформації в білкову оболонку буде упаковуватися тільки одна з ланцюгів ДНК. У всіх векторах типу М13тр використовуються подібні полілінкерние послідовності, тому для ініціації полімеразної реакцій придатний один і той же універсальний праймер. При ампліфікації суміші генів (наприклад, сімейства генів) необхідно провести клонування ПЦР-продуктів у векторах типу М13, внаслідок кожен фаг буде містити тільки одну вставку. При прямому секвенування суміші генів спостерігається кілька однаково розташованих смуг у різних доріжках гелю. При ампліфікації ж одного гена можна проводити пряме секвенування, не вдаючись до проміжного субклонірованію.

Вибір оптимального праймера для ПЛР залежить від 5 '- і 3' -концевих послідовностей амплифицируемого фрагмента ДНК. Крім того, для вбудовування ПЛР-продукту в полілінкерний сайт вектора М13 в 5'-кінець праймерів повинні бути включені відповідні рестрикційні сайти. У цьому випадку ПЛР-ампліфікація з наступною рестрикції продукту дозволить провести його вбудовування в ДНК М13, рестріцірованную тим же ферментом. У різні кінці амплифицируемого фрагмента краще включати сайти для різних рестриктаз, оскільки це дозволить уникнути відпалу векторної ДНК самої на себе і забезпечить становище клонованої вставки в певній орієнтації (так зване спрямоване клонування). При підборі праймерів необхідно враховувати такі фактори.

а. Слід переконатися в тому, що ампліфіціруемого сімейство генів не містить консервативного внутрішнього рестрикционного сайту, ідентичного сайту, включеному в праймер.

б. Після включення рестрикционного сайту 5 '- кінець праймера потрібно подовжити, в іншому випадку рестріктаза НЕ БУДЕ розщеплювати праймер. Необхідна для кожного ферменту довжина виступаючого ділянки і час рестрикції зазначені в каталозі фірми New England BioLabs.

Перед секвенуванням двухцепочечную рекомбинантную ДНК М13 необхідно перевести в одноцепочечную форму. Для цього її вводять шляхом трансформації в компетентні клітини E. сoli. Бляшки, що містять одноцепочечниє рекомбінантні фаги, необхідно виколоти, наростити в бактеріальної культури і депротеінізований.

Потім переносять культуру в мікроцентріфужную пробірку на 1,5 мл і центрифугують мікроцентрифузі при 12 000 g протягом 5 хвилин. Переносять 1 мл супернатанту (що містить чистий фаг) у другу пробірку на 1,5 мл, додають 200 мкл поліетиленгліколю і інкубують при кімнатній температурі як мінімум 15 хвилин. Збирають фаг центрифугуванням протягом 5 хвилин при 12 000 g і відбирають супернатант. Швидко повторюють центрифугування і повністю видаляють всі сліди супернатанта. Потім осаджують ДНК ацетатом натрію, промивають її 70% -ним етанолом і висушують під вакуумом. Розчиняють ДНК в 30 мкл води. Отримана ДНК являє собою одноцепочечную матрицю для секвенування.

Нижче наведена конкретна методика секвенування:

Матеріали

- 5 х реакційний буфер: 200 мМ трис-HCl, рН 7,5, 100 мМ MgCl2, 250 мМ NaCl

- Буфер для розведення ферменту: 10 мМ трис-HCl, рН 7,5, 5 мМ ДТТ, 0,5 мг / мл БСА

- 5 х суміш для мічення: по 7,5 мкМ dGTP, dCTP, dTTP

- Суміш для ddG-термінації: по 80 мкМ dGTP, dATP, dCTP, dTTP, 8 мкМ ddGTP, 50 мМ NaCl

- Суміш для ddA-термінації: по 80 мкМ dGTP, dATP, dCTP, dTTP, 8 мкМ ddATP, 50 мМ NaCl

- Суміш для ddC-термінації: по 80 мкМ dGTP, dATP, dCTP, dTTP, 8 мкМ ddCTP, 50 мМ NaCl

- Суміш для ddT-термінації: по 80 мкМ dGTP, dATP, dCTP, dTTP, 8 мкМ ddTTP, 50 мМ NaCl

- Стоп-розчин: 90% формамід, 20 мМ ЕДТА, 0,05% бромфеноловий синій, 0,05% ксілолціанол

- Універсальний праймер для секвенування - 40 (0,5 пмоль / мкл)

- [35S] dATPS (1 мКи / 37 МБк в 100 мкл) (Amersham, UK; до складу набору не входить)

- 0,1 М ДТТМетодіка

Всі реактиви додають за допомогою диспенсера на 2 мкл Hamilton (PB600), поєднаного з адаптером та шприцом 1710 з газовим затвором. Суміш для мічення попередньо розбавляють в п'ять разів.

1. Для кожної секвенируемой матриці змішують в мікроцен-тріфужной пробірці на 1,5 мл для отримання праймерной суміші 6 мкл води, 1 мкл універсального праймера і 2 мкл реакційного буфера.

2. Розмічають микроплашку Falcon 3911. У верхній її частині наносять номери клонів, а зліва, зверху вниз, - букви TCGA.

3. На дно кожного осередку наносять 2 мкл праймерной суміші, на бічні стінки - по 2 мкл розчину секвенируемой матриці і центрифугують плашку. Накривають її плівкою Saran® і кришкою і поміщають у водяну баню з температурою 70 ° С на 5 хв. Охолоджують плашку на столі (за цей час відбувається відпал праймера і ДНК М13).

4. Поки плашка охолоджується, готують суміш для мічення. Для цього в мікроцентріфужную пробірку на 1,5 мл вносять 0,5 мкл35S-dATP, 1 мкл 0,1 М ДТТ, 2 мкл розведеної суміші для мічення і 3,5 мкл води.

5. Розмічають полікарбонатну микроплашку Techne 96® так само, як першу плашку, і в осередки в ряді "Т" вносять по 2 мкл суміші для ddT-термінації. Аналогічним чином вносять суміш для термінації в осередку інших рядів і поміщають плашку в термостат для мікроплашек з температурою 42 ° С.

6. Після охолодження плашки (п. 3) протягом 30 хв додають до суміші для мічення (для кожної матриці) послідовно 1,77 мкл буфера для розведення ферменту і 0,22 мкл ферменту Sequenase® II. (Це дозволяє тримати фермент Sequenase® II поза холодильника мінімальний час.)

7. По 2 мкл цієї суміші наносять на бічну стінку осередків, містять праймерной суміш, і центрифугують плашку для перемішування компонентів. Включають секундомір.

8. Через 2 хв починають переносити розчин з осередків першої плашки на відповідні осередки попередньо нагрітій і вміщеній в термостат полікарбонатною плашки. Для цього використовують звичайну мікропіпетку, швидко змінюючи наконечники після кожного осередку (пам'ятаєте, що використані наконечники радіоактивні).

9. Після того як перенесений розчин з останньої клітинки, включають секундомір і в наконечник на шприці Hamilton набирають стоп-розчин.

10. Через 5 хв наносять по 5 мкл стоп-розчину на бічну стінку кожного осередку і центрифугують плашку. Після центрифугування плашку, закриту кришкою, можна зберігати в морозильнику до використання (при - 20 ° С35S-продукти можна зберігати протягом тижня).

Ампліфіковані послідовності нуклеотидів можна побачити в УФ-світлі після фракціонування продуктів ПЛР за допомогою гель-електрофорезу впрісутствіі бромистого етидію. У більшості випадків після ПЛР при наявності 1 - 10 нг ДНК-матриці виявляється тільки одна смуга ДНК очікуваної електрофоретичної рухливості. Чутливість та специфічність детекції продуктів ампліфікації значною збільшуються при використанні різних варіантів ДНК-ДНК-гібридизації з олігонуклеотидами-зондами, що мають радіоактивну біотіновую, флюоресцентную або хемолюмінесцентним мітку. Це зробило можливим проведення робіт з мінімально можливою кількістю матеріалу, (наприклад, з одного кліткою, однією копією гена) без попередньої його очистки.

В якості вихідної матриці для ПЛР може бути використана ДНК (або кДНК, отримана за допомогою попередньої зворотної транскрипції РНК), виділена як із свежеполученной клітин і тканин, так і із заморожених, висушених або фіксованих препаратів, що мають частково деградовані нуклеїнові кислоти, т. Е . об'єкти, раніше недоступні для аналізу. Так, за допомогою методів ПЛР була ампліфікувати, клонована і секвенований ДНК єгипетської мумії, продемонстрована можливість аналізу специфічних ділянок ДНК за наявності одного волоса, клітини, сперматозоїда з метою ідентифікації особистості та статі господаря.

Серповидно-клітинна анемія, -таласемія, діабет, ревматоїдний артрит, м'язова дистрофія, фенілкетонурія, гемофілія, дефіцит-антитрипсину - ось далеко не повний список генетичних захворювань, які можуть бути виявлені на ранніх стадіях розвитку ембріона за допомогою ПЛР Розроблено також підходи до раннього виявлення та прогнозуванню онкологічних захворювань.

3. філогенетичного аналізу геном вірусу.

Філогенетичний аналіз молекулярних даних є одним із підходів до теоретичного вивчення структури і функції генетичних макромолекул (РНК, ДНК, білків) та їх еволюційного перетворення. Основна мета філогенетичного аналізу - вивчення еволюційного порядку дивергенції послідовностей генів і білків або їх частин, а також відновлення списків еволюційних подій (замін нуклеотидів, делеций і вставок) в предкової лініях цих макромолекул.

Основним інструментом філогенетичного аналізу є порівняння близьких за структурою або по функції генів або білків, і насамперед, порівняння їх первинних послідовностей.

Найважливішою властивістю функціонально значимих структур макромолекул є їх еволюційний консерватизм. Чим менше функціональна важливість окремих ділянок генів, тим більше вони мають тенденцію до еволюційної мінливості. Так, наприклад, псевдогени мабуть повністю втратили функціональну активність. Для них характерно швидке накопичення в ході еволюції різних замін, делецій і вставок, що руйнують вихідну структуру гена. З іншого боку, гістони Н4, які відіграють важливу роль в упаковці хроматину, майже не змінювалися протягом всієї еволюції тварин.

Консервативність генів дозволяє виявити віддалене спорідненість між їх представниками, давно розійшлися в ході еволюції і виконують іноді різні функції. Однак для філогенетичного аналізу необхідно і наявність певного рівня мінливості генів. Мутації, делеции і вставки є свого роду мітками, завдяки яким вдається відновити шляху еволюції сучасних форм макромолекул. Гени з різною величиною консервативності придатні для вивчення різних еволюційних рівнів. Сильно консервативні гени та їх продукти (гістони, тРНК) не можна, наприклад, використовувати для дослідження еволюції загонів і дрібніших таксонів, але з успіхом можна застосовувати для вивчення еволюції більш великих таксонів. Сильно варіабельні гени, навпаки, дають хороше дозвіл лише на пізніх еволюційних етапах.

Останнім часом метод полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) з подальшим аналізом нуклеотидної послідовності широко використовується для точної ідентифікації вірусів і визначення їх спорідненості відносно інших штамів. Для порівняльної характеристики геномів різних штамів вірусів також проводять рестрикційний аналіз ПЦР-продуктів. Зазвичай для побудови філогенетичного дерева використовуються дані послідовностей нуклеїнових кислот. Філіпченкове дерево дуже ясно показує спорідненість між вірусами, якщо аналізується велика кількість ізолятів. Для цих цілей існує багато комп'ютерних програм. Найбільш популярні пакети програм-PHYLIP (PHYLogeny Inference Package), PAUP (Phylogentic Analysis Using Parsimong), CLUSTAL і MEGA.

Для філогенетичного аналізу особливо цікаві РНК-віруси, які існують як гетерогенні популяції. Їх геном більш генетично пластичний, ніж геном ДНК-вірусів.

Так, геном вірусу сказу, який відноситься до роду Lyssavirus сімейства Rhabdoviridae, представлений одноцепочечной негативної РНК довжиною близько 12000 пар основ (п.о), що кодує п'ять основних білків.

Білки поділяються на три функціональні групи: оболонкові (G, M) нуклеокапсідний (N) і РНК-полімеразної комплекс, що складається з L і NS білків. Білки N, NS і L разом з віріонів РНК утворюють нуклеокапсид, який оточений мембраною, що містить трансмембранний глікопротеїн G, відповідальний за антигенні властивості вірусу. Існування псевдогена y між G і L цистрона, є відмінною рисою вірусу сказу від вірусу везикулярного стоматиту.

N-ген лиссавирусов, як показало клонування і секвенування, є найбільш консервативним за своєю структурою з усіх генів вірусу сказу.

Mannen K.et al, 1991 р визначили велику залежність відмінностей у N-гені від географічної локалізації, ніж від хазяйської специфічності. В Онтаріо вірус сказу, який описаний як єдиний «Арктичний» тип, розділили на чотири основні типи. Ці типи филогенетически розгалужуються на дві основні гілки, одна з яких состовляет один тип, друга три основних типи, що відображає історичне пересування вірусу в регіоні від середини до кінця 50-х рр. Епізоотія пересувалася на південь Онтаріо з півночі та Квебеку. Зміни в послідовності N-гена, визначених для 4-х вірусних типів, можуть представляти генетичний маркер для більш суттєвих змін в інших частинах вірусного генома.

Kissi et al представили перше порівняння між генотипами і молекулярними відмінностями N-гена всередині першого генотипу. Філогенетичний аналіз гена нуклеопротеина 82-х лиссавирусов підтвердив існування шести генотипів лиссавирусов, і також виділив ізоляти сказу першого генотипу в окремі генетичні лінії. Ізоляти з меншою ніж 80% нуклеотидної і 92% амінокислотною гомологією відносяться до різних генотипам. Два коротких регіону з 400 нуклеотидів, які кодують аміноконец N-протеїну, і 93 нуклеотиду, що кодують N-NS-регіон, можуть бути використані для визначення географічного розподілу основних вірусних ліній. Виявлено два регіони, що мають найменший рівень гомології: ділянку довжиною 199 пар основ (нуклеотиди від 1080-го до 1278-го) і більше протяжний фрагмент, розташований між 99-м і 405-м нуклеотидами. Філіпченкове дерево побудували, використовуючи пакет програм MEGA. З їх допомогою отримали дерево з гілками, що діляться на 6 кластерів, які відповідають 6-ти генотипам. Порівняння ізолятів показало, що в генетичному плані найбільш близькими виявилися 4-й і 5-й генотипи, у яких рівень відмінностей склав 79,8% (нуклеотідний рівень) і 93,3% (амінокислотний рівень) [Duvenhage virus (4) і EBL1 (5)]. Усередині генотипу 1 найменше подібність серед ізолятів з Азії та Латинської Америки - 83,3%; і найбільшу схожість в изолятах з Африки та Латинської Америки - 92,2%.

Філогенетичний аналіз ізолятів 1-го генотипу вірусу сказу.

Kissi et al. ідентифікували 11 филогенетических ліній, узятих відповідно до їх географічним походженням і видом господаря: Африка 1а, Африка 1в, Африка 2, Африка 3, Азія, Арктика, Європа / Середній Схід, Латинська Америка 1 і 2 та дві групи вакцинних штамів. Філіпченкове дерево будувалося на підставі порівняння фрагмента або цілого N-гена.

Цей аналіз дозволив більш точно визначити циркуляцію по зонам і встановити походження і поширення сказу для деяких ліній, які, можливо, відбулися незалежно на цьому континенті від різних попередників. Хоча циркуляція африканських вірусів 1а і 1в більш відмінно від вірусів, поширених в Європі і Середньому Сході, проте була виявлена генетична зв'язок між ними, що свідчить про загальний предка.

З'ясовано, що накопичення більшості нейтральних мутацій в географічно розділених вірусних популяціях призвело до значних розбіжностей в нуклеотидної послідовності гена нуклеопротеина.

При дослідженні гена нуклеопротеина 11-ти вірусів сказу японськими вченими було виявлено 9 окремих кластерів по гомології менш 90% регіону N-гена. Тим самим вони підтвердили дані філогенетичного аналізу, отримані Kissi et al.

Таким чином, варіанти вірусу сказу, згруповані відповідно до їх географічним розподілом, можуть бути використані для дослідження еволюційного розвитку вірусу сказу.

Принципи і методи ОТ-ПЦР.

Обернено-транскріптазная ПЛР складається з двох етапів:

1- синтез комплементарної ДНК за допомогою ферменту зворотної транскриптази і затравки

2- ампліфікація гена або його фрагментів за допомогою ферменту термостабільної ДНК-полімерази і коротких олігонуклеотидних 20-30-членних затравок (праймерів), комплементарних 3'- кінцевим послідовностям антіпаралельних ланцюгів ДНК гена. Повторюючи стадії денатурації, відпалу праймерів і полімеризації (добудова праймерів) 30-35 разів за 2-3 години отримують мільйони копій специфічного ділянки геному вірусів і бактерій.

Аналіз ПЦР-продуктів.

Аліквоти ПЛР-продуктів розрізають відповідними ферментами і поділяють в 1% -му агарозному гелі. Облік результатів проводять за розміром ПЛР-продуктів за допомогою електрофорезу в агарозному гелі. На підставі розмірів і відстаней пробігів маркерних ДНК обчислюють розміри досліджуваних фрагментів ДНК.

4. КОМП'ЮТЕРНИЙ АНАЛІЗ ГЕНЕТИЧНИХ ТЕКСТІВ.

Виявлення та аналіз закодованих в послідовностях функціональних сигналів вимагає застосування сучасних методів інформатики - якісних баз даних із сучасними засобами управління, новітніх методів розпізнавання образів, статистичних досліджень, застосування спеціальних алгоритмів для подолання виникаючих обчислювальних труднощів.

В даний час дослідження функціональних властивостей розшифрованих послідовностей нуклеїнових кислот - це новий розділ молекулярної біології, що межує з інформатикою, з одного боку, та молекулярної біофізики - з іншого. Можна з упевненістю сказати, що в даний час аналіз послідовності биополимера дозволяє витягти лише дуже невелику частку закодованої в ній інформації. У кінцевому рахунку точне виявлення функціональних особливостей в послідовностях нуклеїнових кислот буде можливо тільки після детального дослідження відповідних реакцій, здійснюваних нуклеіновобелковимі комплексами.

Для оперативної роботи з послідовностями створюються спеціальні банки даних. У банку в доступному для користувача вигляді зберігається кожна розшифрована послідовність і її паспорт, в якому вказані різні відомості про неї. Це відомості про організм, з якого виділена послідовність, про документ, де вона описана, про розташування на ній регуляторних ділянок та білках, які вона кодує і т.д. В даний час створені три великі бази даних послідовностей нуклеїнових кислот: "Genbank" (Лос-Аламос, США - більше 30 млн. Нуклеотидів), база даних нуклеотидних послідовностей Європейської молекулярно-біологічної лабораторії (EMBL, Гейдельберг, ФРН - понад 30 млн. Нуклеотидів) і "Генекспресс" (СРСР, ВИНИТИ-ІМГ АН СРСР - більше 11 млн. нуклеотидів). Відомі також кілька білкових баз даних, найбільш представницької з якої є MBRF-PIR (США). Ці бази даних поширюються на різних носіях - магнітних стрічках і дисках, на оптичних дисках.

Крім побудови філогенетичних древ геномів вірусів комп'ютерний аналіз застосовується при пошуку гомологий, розпізнаванні кодують областей, функціональних сигналів, фізичному (рестрикційний) картировании молекул ДНК і для передбачення вторинних структур РНК.

Зараз у світі створено велику кількість програм (зазвичай організованих в пакети), призначених для аналізу послідовностей нуклеїнових кислот і избавляющих дослідників від багатьох трудомістких рутинних операцій, у тому числі: підрахунок числа моно -, ди - і трінуклеотідамі, переклад нуклеотидної послідовності в аминокислотную і т .буд.

Всі програми умовно діляться на два класи: загального призначення та спеціального. Перші здійснюють ряд_ найбільш поширених операцій по збору та аналізу послідовностей і дозволяють: вводити і редагувати нові послідовності, зчитувати за допомогою скануючих пристроїв інформацію безпосередньо з автографів або гелів ', знаходити ділянки впізнавання ендонуклеаз рестрикції і представляти результати в зручному (табличному або графічному) вигляді, знаходити ділянки з елементами поворотною і дзеркальній симетрії (паліндроми), транслювати нуклеотидну послідовність в білкову у всіх трьох рамках зчитування, порівнювати дві послідовності методом точкових матриць гомології, порівнювати нову послідовність з усіма даними Ген Банку, знаходити ділянки, збагачені тими чи іншими нуклеотидами, обчислювати гіпотетичну температуру плавлення ДНК, здійснювати автоматичну збірку секвенувати фрагментів в єдину структуру - молекулу ДНК, транслювати білкову послідовність в нуклеотидну з урахуванням нерівномірності використання кодонів-синонімів, визначати молекулярну масу НК і білків, пророкувати вторинну структуру білків, обчислювати вільну енергію освіти шпильок і ін.

Програми спеціального призначення створюються для вирішення більш спеціальних і часто більш складних завдань і становлять інтерес для більш вузького кола фахівців. Так, наприклад, вони можуть виконувати ряд функцій: обчислення довжини фрагментів ДНК на підставі їх електрофоретичної рухливості в гелях; вибір гібрідізаціонних зондів; передбачення вторинної структури РНК; локалізація нуклеотидів в гені, які можуть бути змінені (без зміни амінокислотної послідовності) з метою введення сайту впізнавання ендонуклеази рестрикції; знаходження ділянок з потенційно можливої структурою Z-форми ДНК; виявлення функціонально значимих ділянок в невідомої знову розшифрованої структурі на підставі раніше виведеного консенсусу (в результаті порівняльного аналізу ряду відомих структур з однаковою функцією); локалізацію ділянок, які кодують білки, і т.д.

Для прикладу представлено меню пакета програм MICROGENIE, з яких випливає, які функції загального або спеціального призначення може вибрати дослідник при роботі з нуклеотидними послідовностями.

Програма загального призначення "COMMON" забезпечує введення послідовності в ЕОМ, а також перевірку введених даних в діалоговому режимі. Вони дозволяють також редагувати нуклеотидні послідовності: вводити заміни і вставки, виключати нуклеотиди, вирізати, вбудовувати і об'єднувати нуклеотидні послідовності і таким чином моделювати гібридні і мутантні молекули ДНК. Введення послідовностей в пам'ять машини можна здійснювати вручну з клавіатури, але останнім часом створені прилади для автоматичного сканування авторадиограмм і секвеніруют-чих гелів, отриманих при використанні флуоресцентних міток, передачі даних відразу в комп'ютер і подальшого аналізу послідовності за допомогою спеціальних програм. У нещодавно вийшла у видавництві IRL (Оксфорд) книзі "Аналіз сиквенсу нуклеотидних кислот і білків" докладно описуються як конструкція скануючих пристроїв, так і програми для читання авторадиограмм. Створені програми для відновлення первинних структур високомолекулярних ДНК на базі даних сиквенсу фрагментів, отриманих при її неспецифічних розщепленні (наприклад, ультразвуком,). Спорідненість між будь-якою парою фрагментів ДНК виявляється на підставі збігу послідовності нуклеотидів в їх структурах, причому ці збіжні послідовності і є місцем перекривання і такі два фрагменти можуть бути об'єднані в більш протяжну структуру. Процес відбору фрагментів і стикування триває до. тих пір, поки не буде відновлена вся первинна структура досліджуваної ДНК. Однією з такого роду програм є "CONTIG" (існує її варіант для комп'ютера IBM PC), створена в лабораторії Ф.Сангера (Кембридж, Англія). Нижче наводяться основні операції, які дозволяє здійснювати програма "CONTIG":

1) зберігання сиквенсу кожного фрагмента;

2) відбір суміжних фрагментів та збирання послідовностей з них;

3) порівняння даних, отриманих при читанні нових авторадиограмм, з уже встановленими послідовностями;

4) об'єднання двох фрагментів за допомогою третього, що представляє собою область перекривання перших;

5) пошук ділянок ДНК, комплементарних вже встановленим, що є перевіркою правильності складання повної структури ДНК.

ВИСНОВОК.

Метод Максама-Гілберта і метод Сенгера засновані на одному принципі. У першому використовується специфічне розщеплення ДНК, обумовлене природою підстав, у другому - статистичний синтез ДНК, що закінчується на якомусь одному з 4 нуклеотидів. Таким чином, основою обох методів є отримання повного (статистичного) набору фрагментів ДНК, що закінчуються на кожному з чотирьох нуклеотидів.

Хімічний метод (метод Максама-Гілберта) простіше використовувати в тому випадку, коли досліджувана ДНК не надто велика (200-500 ланок). У тому випадку, якщо мова йде про секвенування високомолекулярної ДНК, краще застосовувати метод полімеразного копіювання (метод Сенгера), щоб не вводити процедуру рестріктазного розщеплення з виділенням індивідуальних фрагментів. При ензиматичну секвенування протяжних одноланцюгових ДНК (наприклад, бактеріофагів) можна застосовувати набір олігонуклеотидів-затравок, синтез яких в даний час не вимагає великих витрат часу і праці. Для двутяжевой високополімерних ДНК найбільш зручний метод сліпого ензиматичного секвенування із застосуванням універсальної затравки (їх випускають багато фірм) та обробки даних за допомогою ЕОМ. Хімічний метод також може бути застосований, але в цьому випадку необхідно вирізати з вектора досліджувані фрагменти ДНК, і це ускладнює всю процедуру.

СПИСОК ЛІТЕРАТУРИ.

1. Жарких А.А. Методи філогенетичного аналізу генів і білків //Молек.біологія. (Підсумки науки і техніки. ВІНІТІ; М. 1985)

2. Комп'ютерний аналіз генетичних текстів / А.А.Александров, Н.Н.Александров, М.Ю.Бородовскій ТА ІН. М .: Наука.

3. Методи молекулярної генетики та генної інженерії. Відп. ред. Р.І.Салганнік.-Новосибірськ: Наука. Сиб. отд-ня, 1990.

4. Молекулярна клінічна діагностіка.Методи: Пер. З англ. / Под ред. С.Херрінгтона, Дж.Макгі. - М .: Світ, 1999.

5. Шабарова З.А., Богданов А.А. Хімія нуклеїнових кислот та їх компанентов. - М .: Хімія, 1978.

6. Шабарова З.А., Богданов А.А., Золотухін О.С. Хімічні основи генної інженерії: Навчальний посібник. - М .: Изд-во МГУ, 1994.

7. Експериментальні методи дослідження білків і нуклеїнових кислот / Подред. М.А.Прокофьева. - М .: Изд-во МГУ, 1985.
Битви російсько-японської війни
Волков В. А. Готуючись до війни з Росією, Японія повинна була насамперед і за всяку ціну завоювати панування на морі. Без цього вся подальша боротьба її з могутнім північним сусідом ставала абсолютно безглуздою. Маленька острівна імперія, позбавлена запасів мінеральної сировини, не тільки

Чума ХХI-ого століття - СНІД
Р Е Ф Е Р А Т На тему: "Чума ХХI-ого століття - СНІД" Керівник: Прошлякова Віолетта Михайлівна Укладач: Тутова Єлизавета Учениця 9 "В" класу Школи №160 Москва 2003 План: I. Вступ. II. Що таке ВІЛ та СНІД. 1) походження вірусу імунодефіциту 2) види ВІЛ, історія появи вірусу

Приватна генетика свині
Введення В даний час в сільському господарстві свиня є головним живіт-ним, вирощуваних на м'ясо, так як саме в свині так вдало поєднуються ряд корисних і зручних для вирощування ознак. Це, по-перше, бис-трий зростання тварини, наприклад, отримавши поросят навесні, у квітні, до груд-рю- січня

Свята Русь в XVII сторіччі
Перевезенцев С. В. Події Смутного часу позначилися і на тому, що на початку XVII століття сталася переорієнтація в прославлянні російських святих і ікон, що шануються. Помітно похитнулося шанування деяких общерусских святинь, що раніше прославляються, що не виявили себе заступниками за Російську

Фотосинтез - простіше простого
Зміст 1. Ведіння... 3 2. Помилка Ван-Гельмонта... 3 3. Саме цікаве з речовин у всьому органічному світі... 6 4. Червоний колір - символ творення... 7 5. Про що оповіли мічені атоми!... 9 6. Зелена електростанція... 10 7. Фотосинтез і урожай... 13 8. «Чарівниця зимою зачарований, ліс стоїть...»...

Явище спадковості
Революція в генетиці була підготовлена всім ходом могутнього розвитку ідей і методів менделізму та хромосомної теорії спадковості. Уже в надрах цієї теорії було показано, що існують явища трансформацій у бактерій; що хромосоми - це комплексні компоненти, які з білка і нуклеїнової кислоти.

Вчення про клітині
Глава1. ВИВЧЕННЯ КЛІТИНИ. КЛІТИННА ТЕОРІЯ Клітина - основна структурна і функціональна одиниця організму. Довгий час біологія вивчала властивості тварин і рослин основі їх макроскопічного будови (видимого неозброєним оком). Глибше в будову і функції організмів вона проникла після відкриття

© 2014-2022  8ref.com - українські реферати