Головна
Банківська справа  |  БЖД  |  Біографії  |  Біологія  |  Біохімія  |  Ботаніка та с/г  |  Будівництво  |  Військова кафедра  |  Географія  |  Геологія  |  Екологія  |  Економіка  |  Етика  |  Журналістика  |  Історія техніки  |  Історія  |  Комунікації  |  Кулінарія  |  Культурологія  |  Література  |  Маркетинг  |  Математика  |  Медицина  |  Менеджмент  |  Мистецтво  |  Моделювання  |  Музика  |  Наука і техніка  |  Педагогіка  |  Підприємництво  |  Політекономія  |  Промисловість  |  Психологія, педагогіка  |  Психологія  |  Радіоелектроніка  |  Реклама  |  Релігія  |  Різне  |  Сексологія  |  Соціологія  |  Спорт  |  Технологія  |  Транспорт  |  Фізика  |  Філософія  |  Фінанси  |  Фінансові науки  |  Хімія

Рекомбінантние(химерные) ДНК - Біологія

1. Рекомбінантние (химерные) ДНК

Генными, що Створюються інженерами рекомбинантные ДНК називають химерными. Вони були створені для самих різноманітних цілей, в тому числі і для целенаправленого впливу на ВИЧ. У останні роки число наукових робіт в цьому напрямі дуже велике. Одна з перевірених схем з використанням химерных ДНК полягала в наступному. До гена, що кодує белок-рецептор CD4, "підшили" інший ген, який забезпечує синтез рослинного білка рицина. Рицин ще в середні віки використовувався як найсильніша отрута. Попадаючи в клітку, він блокує синтез білка в цитоплазме, тим самим вбиваючи її. Після внесення в клітки такий рекомбинантной ДНК в кінцевому результаті відбувається утворення химерного білка, що кодується їй. Та його частина, яка відповідає белку-рецептору, забезпечує суворо специфічне скріплення химери з клітками, на поверхні яких міститься вірусний білок CD4. Інша ж являє собою отруту рицин і знищує клітки, з якими зв'язується химерная молекула. Таким чином, одна частина химери забезпечує направлений пошук в організмі кліток, заражених вірусом, а інша її частина вбиває їх. Схема досить проста і ефективна. Як "вбивця" можна використати не тільки ген рицина, але і деякі інші гени.

Інший підхід до боротьби з ВІЛ-інфекцією заснований на здатності деяких вірусних білків (Tat і Rev), надзвичайно важливих для розмноження ВИЧ в клітках, специфічно зв'язуватися з певними дільницями молекули вірусної РНК. Для того, щоб запобігти цьому життєво важливому процесу, було запропоновано вводити в інфіковані клітки штучно синтезовані РНК, вмісні дільниці скріплення з вірусними білками. Вірусному білку все одно, з ніж зв'язуватися - з вірусної РНК або точно такою ж "копією", сконструйованою искусствено. Додана в клітку у великій кількості, "копія" грає в цьому випадку роль "пастки": якщо її багато, білок вірусу буде зв'язуватися переважно з нею, а не з РНК вірусу, і, внаслідок цього, ВИЧ перестане розмножуватися.

Теоретично описані підходи виглядають дуже привабливо. І, як показали проведені випробування, в ізольованих клітках вони працюють дуже добре. Однак немає надійних способів доставки і забезпечення довгого функціонування химерных "конструктов" в цілому організмі.

Вказані труднощі вчені намагаються подолати за допомогою тих же вірусів. Недавно опубліковане повідомлення про успішне використання для протидії ВИЧ вірусу сказу. Природно, це був не вірус сам по собі, а його варіант, який не здатний приводити до захворювання. До такого варіанту був "пришитий" ген білка CD4. У іншому схема була та ж, що і у випадку з рицином. Зв'язуючись тільки з ВИЧ-інфікованими клітками, рекомбинантный вірус їх знищував, інші ж клітки залишалися незмінними. Можливо, такий шлях виявиться ефективним в майбутньому.

Недавно з'явилося повідомлення об створення ще однієї "химери" проти ВИЧ на основі антиретровирусного препарата энфервиртид.

Энфервиртид являє собою короткий фрагмент білка gp41 ВИЧ, який, незважаючи на те, що він на зразок як "рідної", перешкоджає вірусу "зливатися" з кліткою. На основі ретровируса мишей сконструювали химерный вірус, який здатний в клітках людини проводити такий короткий фрагмент білка ВИЧ і "виставляти" його на поверхні кліток, заражених химерным вірусом. У результаті ВИЧ не може проникати в клітки навіть при наявності в них всіх рецепторов і корецепторов. Таким чином, фрагмент вірусного білка виступає як "щит" проти цілого вірусу. Дуже важливо, що захист спрацьовує на самому початковому етапі інфікування клітки. Адже коли вірус вже проник в неї, з ним боротися практично неможливо. Початі в клініці випробування нової "химери", за твердженням дослідників, дали дуже подаючі надію результати.

2. Конструювання рекомбинантных ДНК

Під рекомбинантными розуміють ДНК, освічені об'єднанням in vitro (в пробірці) двох або більше за фрагменти ДНК, виділені з різних біологічних джерел. Ключовими в цьому визначенні є слова "фрагмент ДНК" і "об'єднання in vitro", що вказує на суть генетичної інженерії і її відмінність від всіх інших методів отримання гібридних (або химерных) організмів, таких як генетична селекція, ембріональна інженерія і т.д.

Фрагменти ДНК, в тому числі і фрагменти, вмісні гени, отримують з використанням ферментів рестриктаз. Рестриктазы можуть утворювати фрагменти як з тупими, так і з липкими кінцями. Сшивка фрагментів ДНК виробляється трьома основними методами, що залежать від того, які кінці мають фрагменти ДНК, що зшиваються.

Сшивка по однойменних "липких" кінцях (рестриктазно лигазный метод)

Цей метод є самим поширеним і популярним. Уперше цим способом гібридна ДНК була отримана С. Коеном з співробітниками в 1973 році. Деякі рестриктазы, наприклад Pst I, вносячи в ланцюгу ДНК симетричні, розташовані навскоси один від одного розриви на рівних відстанях від центра сайта пізнавання і створюючі "сходинку" (мал. 36). Ці комплементарные один одному дільниці мають тенденцію до асоціації за рахунок спаровування основ, і тому їх називають комплементарными або липкими кінцями. Спаровування основ відбувається тільки між комплементарными послідовностями, тому ААТТ-кінці, що утворюються Eco RI, не будуть злучатися, наприклад, з АГЦТ-кінцями, що утворюються Hind III. Але будь-які два фрагменти (незалежно від їх походження), що утворилися під дією однієї і тієї ж рестриктазы, можуть злипатися за рахунок утворення водневих зв'язків між однонитевыми дільницями комплементарных нуклеотидов (мал. 39).

Однак після такого спаровування повної цілісності двійчастої спіралі не відновиться, оскільки залишиться два розриви в фосфодиэфирном кістяку. Для його відновлення, тобто зшиття, або лигирования ниток використовують фермент ДНК-лигазу. Цей фермент в живій клітці виконує ту ж функцію - зшиття фрагментів ДНК, що синтезуються при реплікації.

Сшивка по "тупих" кінцях (коннекторный метод)

Липкі кінці не абсолютно необхідні для скріплення фрагментів ДНК. Тупі кінці також можуть бути сполучені за рахунок дії ДНК-лигазы, якщо і лигаза, і тупі кінці присутні в реакційній суміші у високих концентраціях. У цьому випадку реакція лигирования має свої особливості і її ефективність нижче, ніж при сшивке по липких кінцях. Уперше такі експерименти були виконані в 1972 році Полем Бергом в Стенфордськом університеті, США. Липкі кінці також можна ферментативным шляхом приєднати до молекул ДНК з тупими кінцями. Для цього використовують фермент - кінцеву трансферазу з тимуса теляти, яка приєднує нуклеотиды до 3 -кінців ланцюгів ДНК. Якщо до 3'-кінців одного з рекомбинируемых in vitro фрагментів ДНК з допомогою кінцевий дезоксинуклеотидилтрансферазы добудувати одноцепочечные олиго (dA)-сегменти певної довжини, а до кінців іншого фрагмента - олиго (dT)-сегменти приблизно такої ж довжини, то при змішенні отриманого таким чином фрагментів відбувається спаровування за рахунок утворення водневих зв'язків між олиго (dА) -і олиго (dT) -послідовностями (мал. 40). Для ковалентного з'єднання двох фрагментів використовується ДНК-лигаза. Ці процедури складають основу для другого загального методу отримання рекомбинантных молекул ДНК.

Оскільки можна формувати досить довгі взаимокомплементарные одноцепочечные кінці, гібридні молекули утворяться з високою ефективністю. Зокрема, тому при клонуванні ДНК-списів матричних РНК, які доступні в обмежених кількостях, звичайно исмпользуют коннекторный метод. При такому способі з'єднання між фрагментами вбудовуються дільниці ААААА. Такі додаткові послідовності ТТТТТ можуть впливати на функції молекул, що з'єднуються і тому завжди, коли тільки можливо, для отримання рекомбинантных молекул ДНК користуються липкими кінцями, що утворилися внаслідок дії рестриктаз.

Сшивка фрагментів з різнойменними липкими кінцями

В ситуації, коли необхідно зшити фрагменти, освічені різними эндонуклеазами рестрикції, і маючі різні, тобто некомплементарные один одному липкі кінці, застосовують так звану лінкер (або "переходники"). Лінкер - це хімічно синтезовані олигонуклеотиды, що являють собою сайты рестрикції або їх комбінацію. Уперше цю ідею запропонував Шеллер з співробітниками в 1977 році.

Існують великі набори таких "генных переходников". Природно, що при використанні лінкер повинна враховуватися необхідність дотримання правил експресії генетичної інформації. Часто в середину лінкер вміщують який-небудь регуляторный генетичний елемент, наприклад, промотор або дільниця, пов'язана з рибосомой. У цьому випадку лінкер забезпечують не тільки об'єднання генів, але і обумовлюють їх експресію. Існують лінкер "тупий кінець - липкий кінець".

При необхідності липкі кінці можна перетворити в тупі. Це досягається або отщеплением липких кінців за допомогою ферменту - эндонуклеазы S1, яка руйнує тільки одноцепочечную ДНК, або липкі кінці "забудовують", тобто з допомогою ДНК-полимеразы I на однонитевых липких кінцях синтезують другу нитку.

3. Визначення нуклеотидной послідовності (секвенирование) ДНК

Описані методи, що дозволили ідентифікувати генетично важливі дільниці ДНК, мали велике значення самі по собі. Але вони також проклали шлях до розробки виключно ефективних методів секвенирования ДНК і створення рекомбинантных молекул. Секвенирование дозволяє досить швидко визначити повну нуклеотидную послідовність сегмента довжиною 100 - 500 нуклеотидных пар, що утворюється при розщепленні ДНК рестрикционными эндонуклеазами.

Метод Маськама і Гилберта (хімічний)

Один з методів заснований на хімічній деградації ДНК. Він був запропонований в 1976 році Максамом і Гилбертом і названий їх ім'ям. Суть методу зводиться до наступного: один з кінців фрагмента ДНК мітять за допомогою ізотопу фосфору 32Р. Останнім часом замість радіоактивної вводять флюоресцирующую мітку. Її можна «чіпляти» і до нуклеотидам, причому для кожного типу нуклеотидов підбирати різне забарвлення. Препарат міченої ДНК ділять на чотири порції і кожну з них обробляють реагентом, що специфічно руйнує одне або два з чотирьох основ, причому умови реакції підбирають таким чином, щоб на кожну молекулу ДНК доводилося лише декілька пошкоджень.

Руйнування йде в 2 етапи. На першому етапі відбувається модифікація азотистої основи і подальше выщепление його. На другому етапі проводять гідроліз ДНК в місцях выщепления основ. Пуриновые основи модифікуються диметилсульфатом. Адениновые залишки метилируются по третьому атому азоту, гуаниновые - по положенню N7. Якщо таку модифікацію обробити 0,1 М HCl при 0оС, то выщепляется метиладенин. При подальшій інкубації в лужному середовищі (0,1 М NaOH) при температурі +90оС відбувається руйнування сахаро-фосфатного зв'язку в місцях выщепления основ. Обробка пошкоджених молекул пиперидином приводить до гидролизу ДНК по залишках метилгуанина. Пиримидиновые основи модифікуються гидразином. У бессолевой середовищі модифікується і цитозин, і тимин, в присутності 2 М NaCl модифікується тільки цитозин. При подальшій обробці пиперидином відбувається розщеплення ДНК по точках модифікації. Можна використати і інші реакції хімічної модифікації основ і розщеплення по них молекул ДНК. У результаті виходить набір мічених фрагментів, довжини яких визначаються відстанню від зруйнованої основи до кінця молекули. Фрагменти, що утворилися у всіх чотирьох реакціях, піддають электрофорезу в чотирьох сусідніх доріжках; потім проводять радиоавтографию, і ті фрагменти, які містять радіоактивну мітку, залишають "відбитки" на рентгенівській плівці. По положенню відбитків можна визначити, на якій відстані від міченого кінця знаходилася зруйнована основа, а знаючи цю основу - його положення. Так набір смуг на рентгенівській плівці визначає нуклеотидную послідовність ДНК. Аналогічно спостерігають флуоресцентне фарбування. Якщо для кожного з чотирьох нуклеотидов був підібраний свій колір флуоресцентної мітки, то при электрофорезе їх наносять на 1 доріжку. Тоді розташування нуклеотидов відмічене штрихами різного кольору, а процедуру лічення легко автоматизувати.

Метод Сенгера (ферментативный)

Інший метод, розроблений Сенгером і що носить його ім'я, заснований не на хімічному, а на ферментативном підході. Сэнгер використав ДНК-полимеразу I. В клітці цей фермент бере участь в процесі реплікації, заповнюючи пропуски між знову синтезованими фрагментами ДНК (фрагментами Оказаки). Для роботи ферменту в пробірці потрібно попередники ДНК - дезоксирибонуклеотидтрифосфаты (dNTP), а також одноцепочечная матриця, на якій повинен бути невеликою двухцепочечный дільниця - затравка, з якого починається синтез (мал. 41). Були також синтезовані модифіковані дидезоксирибонуклеотиды, в яких дезоксирибоза 3'-ВІН відсутній, для кожного з чотирьох основ ДНК. ДНК-полимераза включає ці попередники в ДНК. Однак, включившись в ДНК, модифіковане основу не може утворити фосфодиэфирную зв'язок з наступним дезоксирибонуклеотидом. У результаті зростання (элонгация) даного ланцюга зупиняється (терминируется) в тому місці, де в ДНК включився дидезоксирибонуклеотид (ddNTP). Тому їх називають терминаторами элонгации.

Реакційна суміш по Сенгеру складається з ланцюга ДНК, нуклеотидную послідовність якої треба визначити, короткого фрагмента "міченої" ДНК, комплементарной кінцевому відрізку цього ланцюга (затравка), одного з чотирьох ddNTP і відповідного dNTP в суворо певному співвідношенні (щоб вони конкурували), а також інших трьох dNTP. Готують чотири суміші, кожна з яких містить один з чотирьох ddNTP. У кожній з пробірок утвориться набір мічених фрагментів різної довжини. Довжина їх залежить від того, в якому місці в ланцюг включений дефектний нуклеотид. Отримані мічені фрагменти ДНК розділяють в полиакриламидном геле (з точністю до одного нуклеотида), проводять радиоавтографию і по картині розподілу фрагментів в чотирьох пробах встановлюють нуклеотидную послідовність ДНК (мал. 41).

У цей час визначення точної нуклеотидной послідовності будь-якого сегмента ДНК помірної довжини - цілком вирішувана задача. Вже визначена послідовність декількох сотень генів про- і эукариот. Знаючи послідовність гена і генетичний код, легко визначити амінокислотну послідовність білка, що кодується ним. Раніше для визначення структури білка доводилося робити ретельний і вельми трудомісткий аналіз виділеного і обчищеного білка. Зараз часто буває простіше визначити структуру білка через нуклеотидную послідовність, чим з допомогою прямого секвенирования. Якщо секвенирование білка займає місяці і навіть роки, то ДНК вдається секвенировать за декілька тижнів.

Визначення послідовності ДНК привело також до того, що були виявлені області, які не кодують білки, але беруть участь в регуляции експресії генів і реплікації ДНК. У 1996 році був секвенирован геном дріжджів, в 1998 р. - геном арабидопсиса, в 2000 році - геном людини, однак в цьому випадку мова йде тільки про встановлення послідовності нуклеотидов, оскільки генетична структура і функції окремих дільниць генома ще не ідентифіковані, це більш складна задача.

Відразу услід за розробкою швидких методів секвенирования з'явилися так же швидкі і прості методи синтезу порівняльне довгих олигонуклеотидов з певною, зазделегідь заданою послідовністю. Тепер за три-чотири дні можна синтезувати послідовність з 12 - 20 нуклеотидов. Автоматизація цієї процедури ще більш полегшує і прискорює синтез. З'явилися прилади - ДНК-синтезатори, які виконують цю роботу за декілька годин.

Гібридизація як високочутливий метод виявлення специфічних послідовностей нуклеотидов

Якщо водний розчин ДНК нагріти до 100оС і підвищити рН до 13, то ДНК диссоциирует на 2 ланцюгу (денатурирует), оскільки комплементарные зв'язку між основами руйнуються. У 1961 році було виявлено, що цей процес звернемо: витримання ДНК при температурі 65оС вело до відновлення структури двійчастої спіралі. Цей процес називається ренатурация або гібридизація. Процеси гибридизации відбуваються між будь-якими одинарними ланцюгами, якщо вони комплементарны: ДНК - ДНК, РНК - РНК, ДНК - РНК.

Для тесту необхідно мати чистий одноцепочечный фрагмент ДНК, комплементарный тієї послідовності, яку хочемо виявити. Цей фрагмент отримують або клонуванням, або шляхом хімічного синтезу. Одноцепочечная ДНК, що використовується як індикатор, називається ДНК-зонд. Вона може містити від 15 до 1000 нуклеотидов.

ДНК-зонди застосовуються в різних цілях. Гібридизація ДНК-зонда з РНК, виділеної з клітки, що аналізується, може виявити наявність або відсутність експресії гена. Якщо гибридизации не відбувається, означає ген мовчить, не працює. ДНК-зонди також дозволяють провести діагностику спадкових хвороб.

У більшості випадків мутації, ведучі до спадкових хвороб, рецессивны, тобто хвороба розвивається, якщо людина отримує дефектні гени від обох батьків. Аномальні ембріони краще виявляти до народження. Наприклад, для серповидноклеточной анемії в мутантном гені, що кодує бэта-ланцюг гемоглобіну, послідовність ГАГ замінена на ГТГ. У цьому випадку синтезують олигонуклеотид довжиною біля 20 основ, мітять радіоактивною міткою. З ембріональних кліток, що містяться в амниотической рідині, виділяють ДНК і використовують її для гибридизации. Якщо ембріон дефектний, то тест буде позитивним.

Аналіз проводять по наступній схемі (мал. 42): досліджувану ДНК гидролизуют рестриктазами, фракционируют электрофорезом, переносять розділені фрагменти на нитроцеллюлозный фільтр і проводять реакцію гибридизации з міченими олигонуклеотидами. Цей метод був розроблений Саузерном в 1975 році. У вітчизняній літературі його прийнято називати «південний блоттинг». «Блоттинг» - в перекладі з англійського означає «промокашка», «саузерн» - «південний», в цьому випадку гра слів: прізвище вченого переводиться як географічний напрям.

Молекули ДНК розганяють в агарозном геле электрофорезом. ДНК в геле денатурируют лугом. Луг нейтралізують і пластину геля покривають листом нитроцеллюлозы. Зверху на нитроцеллюлозу вміщують чарку листів фильтровальной паперу, забезпечуючи повільний струм буферного розчину через гель в напрямі, перпендикулярному напряму электрофореза. ДНК диффундирует з геля і зв'язується з нитроцеллюлозным фільтром. Після прогрівання фільтра при 80оС у вакуумі ДНК безповоротно зв'язується з нитроцеллюлозой. Розташування смуг иммобилизованной ДНК точно відповідає їх розташуванню в геле.

ДНК, пов'язану з нитроцеллюлозным фільтром, можна гибридизовать з радіоактивно міченої ДНК. Блоттинг по Саузерну є виключно корисним також і для локалізації генів, що вивчаються в певних фрагментах, отриманих внаслідок гидролиза різними рестриктазами гібридних молекул ДНК, хромосомній ДНК і т. д.

Аналогічним методом на нитроцеллюлозу переносять молекули РНК (Північний блоттинг) і білка (Західний блоттинг). З частин світу залишилася вільною тільки західна, хоч вакантними залишилися 2 класи макромолекул - вуглеводи і липиды.

Одним з найбільш точних і сучасних методів аналізу є використання чопів. Вони являють собою пластинки з иммобилизованными міченими ДНК-зондами. Кожна така пластинка може містити декілька десятків тисяч зондів, розташованих в певній послідовності. Мітка виявляється тільки в спарених двухцепочечных фрагментах. Якщо в досліджуваному зразку є послідовності, комплементарные послідовностям зонда, то гибридизацию можна визначити візуально або за допомогою спеціальних приладів. Як правило, детектори сполучені з комп'ютером, тобто процедура лічення і обробки інформації автоматизована.

Такі ДНК-чопи можна застосовувати для комплексної діагностики інфекційних захворювань, спадкових дефектів, встановлення експресії тих або інакших генів (в цьому випадку йде гібридизація з мРНК), тобто відстеження порушень обміну речовин. Вони дешеві, дуже надійні, прості в звертанні і можуть багато разів використовуватися. Недолік - дорога апаратура для детекции.

4. Методи клонування ДНК

Після того, як ДНК зшита в пробірці, її необхідно розмножати.

Існує два підходи до клонування ДНК. Перший підхід передбачає використання бактерійних або дрожжевых кліток для розмноження введеною в них чужеродной ДНК. Другий спосіб являє собою амплификацию ДНК in vitro.

Клонування ДНК in vivo

Використовуючи мікроорганізми, можна створювати два типи бібліотек ДНК: геномную і клоновую (кДНК).

Геномная бібліотека. Якщо геном якого-небудь організму розрізати, вставити в плазмидные або вірусні вектора і ввести в клітку, то у такому вигляді його можна зберегти. При розрізанні плазмидной або фаговой ДНК імовірність випадання цілого і незмінених шматків генома досить висока.

Такий спосіб отримання геномной бібліотеки отримав назву «метод дробовика», оскільки геном в цьому випадку представлений окремими фрагментами.

Принципи створення плазмидных і вірусних векторів загальні, тому розглянемо їх на прикладі плазмидных. Потрібно відмітити, що з вірусних ДНК краще використати ДНК фагов, оскільки вони мають велику ємність і дозволяють вставляти більш великі шматки генома.

Обчищені кільцеві молекули ДНК обробляють рестриктазой, отримуючи лінійну ДНК. Клітинну ДНК обробляють тієї ж рестриктазой, додають до плазмидной, додають лигазы. Таким чином отримують рекомбинантную плазмидную ДНК, яку вводять в бактерійні або дрожжевые клітки. Плазмида реплицируется з утворенням багатьох копій. Багато які плазмиды несуть ген стійкості до антибіотиків, і якщо в рекомбинантной плазмиде є такий ген, то клітки легко виявляти, вирощуючи на середі з антибіотиком.

Кожна така колонія являє собою клон або потомство однієї клітки. Плазмиды однієї колонії містять клон геномной ДНК, а сукупність плазмид можна назвати бібліотекою геномной ДНК. Нестача такого методу в тому, що фрагменти ДНК утворяться у величезній кількості. Розрізання геномной ДНК визначається випадком, тому лише частину фрагментів містять повноцінні гени. Деякі фрагменти можуть містити тільки частину гена або ж интронные послідовності.

Бібліотека кДНК. Створення кДНК починається з синтезу на матриці РНК за допомогою зворотної транскриптазы комплементарной нитки ДНК. Потім створюють лужні умови, руйнують ланцюг РНК на нуклеотиды, після чого з допомогою ДНК-полимеразы синтезують комплементарную ланцюг ДНК. При цьому утвориться фрагмент ДНК з тупими кінцями. Таку ДНК вбудовують в плазмиды і вводять в клітки бактерій. При амплификации плазмиды утвориться клон комплементарной копії ДНК (кДНК).

Переваги клоновой ДНК перед клонами геномной ДНК в тому, що кодуюча білок нуклеотидная послідовність гена нічим не уривається.

Гени эукариот містять интроны, які повинні віддалятися з транскриптной РНК перед перетворенням її в матричну, після чого слідує сплайсинг (зрощення). Бактерійні клітки не можуть здійснювати таку модифікацію РНК, що утворилася шляхом транскрипції гена эукариотической клітки. Тому якщо переслідують отримання білка шляхом експресії клонуваного гена, то краще використати банк кДНК, отриманої на основі матричної РНК.

Методи клонування ДНК

Полімеразная ланцюгова реакція

В 1985 році К. Мюлліс з співробітниками розробили метод клонування послідовностей ДНК in vitro, який отримав назву полимеразной ланцюгової реакції (ПЦР).

До зразка, що аналізується ДНК додають в надлишку 2 синтетичних олигонуклеотида - праймера розміром біля 20 нуклеотидов. Кожний з них комплементарен одному з 3'-кінців фрагмента ДНК. ДНК нагрівають для розділення ланцюгів двійчастої спіралі, а при охолоджуванні відбувається гібридизація праймеров з комплементарными дільницями фрагментів ДНК. У результаті в розчині будуть знаходитися однонитевые ДНК з короткими двухцепочечными дільницями - затравка (праймерами). При додаванні нуклеотидов і ДНК-полимеразы синтезуються комплементарные ланцюга і утворяться ідентичні фрагменти ДНК (перший цикл, мал. 43). Реакція зупиняється і ДНК знов денатурируется прогріванням.

У процесі охолоджування праймеры, що знаходяться в надлишку, знову ефективне гибридизуются, але вже не тільки з ланцюгами початкової ДНК, але і із знову синтезованими. Внесення в систему ДНК-полимеразы ініціює другий цикл полимеразной реакції. Багаторазове повторення описаної процедури дозволяє провести 30 і більше за цикли ферментативного подовження праймеров. При цьому число сегментів ДНК, обмежених з обох кінців праймерами, що використовуються, з кожним циклом ПЦР збільшується експонентно (наближається до залежності 2n, де n - число циклів). Вихід всіх інших продуктів реакції збільшується по лінійній залежності (мал. 44). Таким чином, в процесі реакції, що розглядається ефективно амплифицируется тільки та послідовність ДНК, яка обмежена праймерами.

Спочатку для ПЦР використали фрагмент Кленова ДНК-полимеразы I E. coli. Однак недоліком даного підходу було те, що після кожного циклу реакції необхідно було вносити в реакційну суміш нову порцію ферменту. Крім того, в оптимальних температурних умовах такої полимеразной реакції (37 °З) з'являлися повторні дільниці скріплення праймеров і спостерігалася ампліфікація незапланованих сегментів генома, т. е. специфічність амплификации не була повною. Істотне поліпшення методу полимеразной ланцюгової реакції було досягнуте після заміни фрагмента Кленова на ДНК-полимеразу термофильной бактерії Thermus aquaticus (Taq-полимераза). Температурний оптимум реакції, що направляється Taq-полимеразой, знаходиться в районі 70 °С. Другим важливою властивістю є те, що дана полимераза не инактивируется після тривалої інкубації при 95 ° По-перше, термостабильная полимераза не инактивируется на етапі денатурации ДНК, і тому немає необхідності після кожного циклу реакції додавати нову порцію ферменту. Таке спрощення процедури дозволило автоматизувати проведення ПЦР, оскільки тепер було потрібен лише перенесення зразка з певним інтервалом часу в різні температурні умови: 90-95 °З (температура денатурации) і 60-70 °З (температура ренатурации ДНК і ферментативной реакції). По-друге, високий температурний оптимум реакції, катализируемой Taq-полимеразой, дозволяє підбирати жорсткі температурні умови відпалу, що забезпечують гибридизацию праймеров тільки в заданому районі генома, що вивчається, що істотно підвищує специфічність і чутливість методу.

Використовуючи метод ПЦР, можна in vitro селективно збагачувати препарат ДНК фрагментом з певною послідовністю в мільйон і більше за рази. Це дозволяє надійно виявляти однокопийные гени і їх варіанти в таких великих і складних геномах, яким є геном людини. Чутливість методу така, що амплифицировать в ПЦР і виявити цільову послідовність можна навіть в тому випадку, якщо вона зустрічається одного разу в зразку з 105 кліток. Сегмент, що Отримується ДНК надійно виявляється у вигляді дискретної смуги після электрофоретического розділення молекул ДНК і забарвлення їх этидиум бромідом. Якщо до праймеру пришити фермент, то ферментна мітка буде нагромаджуватися при амплифицировании. Продукт амплификации перевіряється за принципом ИФА, тобто додається субстрат і відмічається зміна забарвлення. Як мітка можна використати стрептавидин (див. розділ 3). Його можна пришивати як до праймеру, так і до нуклеотидам. У останньому випадку нуклеотиды, мічені стрептавидином, додаються до звичайних, що йдуть на синтез комплементарной ланцюга ДНК. Цим досягається ще більше посилення сигналу.

Розмножати in vitro фрагмент отримують в кількостях, достатніх для його прямого секвенирования. Оскільки при цьому не потрібно проміжний етап клонування фрагмента ДНК в молекулярних векторах, ПЦР іноді називають бесклеточным молекулярним клонуванням (cell-free molecular cloning). Автоматизована процедура Taq-полимеразной ланцюгової реакції, що складається з 30 і більше за цикли, займає 3-4 години, що істотно швидше і простіше процедури клонування певного

5.Контроль над дослідженнями рекомбинантных ДНК

Спори про роль генетики почалися задовго до сучасного розквіту генной інженерії. Ще в 1970-х роках не тільки вчене співтовариство, але і широка публіка прийнялися обговорювати питання, пов'язані з суперечливими перспективами нових біологічних технологій. У чому ж укладалося основне питання? Основною темою суперечок була рекомбинантная ДНК, яку називали також химерной ДНК. У лабораторних умовах стало можливим створювати штучні ДНК, комбінуючи між собою гени різних видів і отримуючи такі поєднання, які б ніколи не зустрілися в природі. Більшість штучних ДНК синтезуються в наукових цілях. Це контрольовані експерименти, на основі яких вчені прагнуть отримати нові відомості про біологічні системи, що вивчаються ними. Однак в деяких випадках дослідникам просто цікаво «подивитися, що вийде». Часто виходять очікувані результати, але часом відбувається щось несподіване. І це цілком з'ясовне з наукової точки зору: адже ми ніколи не можемо зазделегідь все знати і все передбачити. Тому вчені ніколи не можуть обіцяти, що отримані ними клітки з рекомбинантными ДНК будуть абсолютно безпечними. Саме така невпевненість і послужила відправною точкою для дискусій з приводу небезпек сучасної генетики.

З такою проблемою зіткнулися молекулярні біологи, що вивчали в 1970-х роках гени вірусів, зухвалих виникнення рака, і що впроваджували їх в бактерії Е. coli. При цьому вони керувалися благими намірами: вивчити функції ракових генів на прикладі простих біологічних систем. Але за допомогою даної технології можна було б створити і шкідливі канцерогенні бактерії, що заражають людей. По мірі розвитку технології вчені все більш приходили до думки про небезпечний напрям своєї роботи і задумувалися про її глобальні наслідки. Зрештою, 11 відомих молекулярних біологів опублікували відкритий лист в престижних журналах «Nature» і «Science», закликавши своїх колег накласти мораторій на певні види експериментів і з більшою обережністю відноситися до інших дослідів. Зокрема, вони пропонували ввести заборону на експерименти з генами стійкості до антибіотиків, генами токсинів і генами канцерогенних вірусів; закликали організувати дискусію на цю тему; просили Національний інститут здоров'я США (NIH) розробити правила і принципи проведення подібних експериментів.

Для вченого співтовариства це був крок величезної важливості: перед особою невідомої і загалом-то не цілком визначеної небезпеки вчені усвідомлено стримувалися від проведення експериментів. Що Підписалися під цим листом, видно, не чекали, який резонанс викличе їх заяву у всьому світі.

Як тільки про лист стало відомо засобам масової інформації, широка публіка сприйняла потенційну небезпеку, як цілком реальну. «Якби ці експерименти не були так небезпечні, - часто міркували люди зі сторони, - те хіба вчені стали б їх забороняти?» Однак технологія отримання рекомбинантных ДНК відкрила абсолютно нові напрями досліджень. Перспективи отримання Нобелівської премії і величезних економічних вигід також бентежили вчених. До часу проведення дискусій багато хто з них вже прагнув не стільки обговорити можливі етичні проблеми, скільки переконати публіку в безпеці своїх робіт. Те, що починалося як відповідальний вчинок, перетворилося в небажання допускати в свої плани непосвячених. І хоч багато які протиріччя до нашого часу вже вдалося більш або менш дозволити, так і напруження пристрастей знизилося, було б корисно стисло нагадати про суть цих суперечок.

З 24 по 27 люті 1975 року ряд відомих у всьому світі молекулярних біологів зібрався в Аси-ломаре, поблизу міста Монтерей в штаті Каліфорнія. Деякі з тих, що зібралися заявили, що етичні побоювання перебільшені і зажадали продовження важливих досліджень. Інші були стурбовані можливими законодавчими постановами або судовим переслідуванням, якщо буде доведено, що дослідження представляють небезпеку для здоров'я. Багато які ж просто вважали, що вони даремно тратять час. На конференції була прийнята постанова продовжувати дослідження і замінити мораторій на ряд принципів, яких потрібно дотримуватися при проведенні експериментів з різною мірою ризику. Були висловлені наступні пропозиції:

збільшити число рівнів безпеки для експериментів, що представляють високу міру потенційного ризику;

використати ослаблені різновиди генетично змінених мікроорганізмів в спеціальних лабораторних умовах.

Головна трудність тоді (проте, як і зараз) полягала в тому, щоб оцінити міру ризику таких обставин, про які ще мало що відоме. Національний інститут здоров'я, що фінансує велику частку біологічних проектів, взяв ініціативу в свої руки і розробив ряд положень, запропонувавши їх для відкритого обговорення. Для визначення правил проведення досліджень був освічений Комітет по рекомбинантной ДНК, що складався з експертів різних областей біології, а також з представників приватних компаній, що використовують нові технології. Подальші дискусії також розгорталися в основному навколо можливих небезпек. І хоч від представників промислових компаній варто було чекати того, що вони будуть ратувати за практично вільне експериментування, багато хто з них виявив відповідальність і висловився за регулювання досліджень. Вони також побоювалися можливих негативних наслідків і судових позовів у разі нанесення збитку з їх сторони, а тому також запропонували розробити основні принципи. Інші ж вчені затверджували, що їм не дають працювати, хоч дослідження в області рекомбинантной ДНК допомогли б вирішити такі глобальні проблеми, як голод і інфекційні хвороби.

23 червня 1976 року Дональд Фредеріксон, директор Національного інституту здоров'я, затвердив ряд формальних правил досліджень в області рекомбинантной ДНК, дотримуватися яких повинні були всі, хто отримує гранти від цього інституту. У них були визначені чотири рівні фізичної безпеки досліджень згідно з оціненою мірою їх ризику. Перший рівень - нешкідливі експерименти з використанням стандартних біологічних технологій. З кожним подальшим рівнем кількість обмежень і застережень зростала настільки, що для експериментів четвертого рівня - на зразок тих, що показані в фільмі «Штам Андромеди», - відповідних лабораторій не існувало аж до 1978 року. Крім того, три штами Е. coli були розподілені по трьох рівнях біологічної безпеки. Стандартні лабораторні штами визначили як ЕК1. Штами ЕК2 були визначені як такі, що характеризуються навмисно викликаною мутацією, здатні вижити поза лабораторією з імовірністю 1 х 10-8. ЕКЗ - ті ж штами, тільки абсолютно не здатні вижити в організмах тварин і рослин або поза лабораторією. Для того щоб виростити ослаблений штам Е. coli, в який можна було б впровадити рекомбинантную ДНК, Рій Кер-тісс, член комітету при Національному інституті здоров'я, розробив штам хи-1776 (в честь 200-летия проголошення незалежності США), вмісний 15 окремих блоків для нормального розмноження. Роль, яку освічена публіка може зіграти при розв'язанні питань, пов'язаних з регулюванням потенційно небезпечних наукових досліджень, прояснилася в ході одного з обговорень в Кембрідже (штат Массачусетс). У той день, коли були опубліковані правила проведення генетичних експериментів, мер Кембріджа Альфред Ве-луччи відкрив публічні слухання з приводу пропозиції побудувати спеціальну лабораторію по перенесенню генів тваринного вірусу SV40 в Е. coli. Цю пропозицію висунув Марк Пташне, вчений Гарвардського університету. На цьому слуханні був присутній один з авторів цієї книги. У Кембрідже, де розташовуються Гарвардський університет і Мас-сачусетський технологічний інститут, звичайно ж вже були численні лабораторії, де проводилися генетичні експерименти, але будівництво нової будівлі вимагало дозволу міської ради, і пропозиція Пташне, що отримала широкий розголос, вирішила обговорювати на відкритому засіданні.

Протягом двох з половиною годин перед представниками телебачення, радіо і преси, а також перед сотнями що зібралися виступали прихильники і противники будівництва. Одні вчені приводили аргументи про необхідність будівництва, затверджуючи, що така лабораторія надзвичайно корисна для вивчення рака, тоді як ризик виведення небезпечних бактерій «надто невеликий». Інші вчені і представники громадськості затверджували, що непередбачені інциденти вже неодноразово відбувалися в самих надійно захищених лабораторіях і що, якщо будуть виведені небезпечні мікроорганізми, їх вже не можна буде зупинити. Питання мера і його радників показували, що вони добре підготувалися до слухань і ознайомилися з матеріалом. На закінчення мер зажадав накласти дворічний мораторій на всі дослідження рекомбинантной ДНК, що проводяться в Кембрідже, але міська рада запропонувала створити Експериментальну цивільну раду по перегляду (CERB) в складі восьми членів, не належних до кола вчених. У нього увійшли чотири чоловіки і чотири жінки: лікар, філософ, агент по продажу пального, інженер-проектувальник, клерк, медсестра, соціальний працівник і домогосподарка. Члени ради ознайомилися з необхідними спеціальними відомостями з молекулярної біології і в січні 1977 року винесли одноголосне рішення - схвалити будівництво лабораторії. Цей комітет створив прецедент для подальших слухань подібного роду з приводу досліджень в області рекомбинантной ДНК. Даний випадок показав, що звичайні громадяни цілком здатні зрозуміти наукові проблеми і винести здорове рішення, не перешкоджаюче розвитку науки і що не представляє небезпеки для суспільства.

У Великобританії питання об рекомбинантной ДНК було вирішене інакшим образом. Уряд заснував Консультативну групу по генетичних маніпуляціях (Genetic Manipulation Advisory Group, GMAG), до складу якої увійшли політики, вчені і представники профспілок. Всі експерименти, що пропонуються в області рекомбинантной ДНК повинні отримати схвалення GMAG, прийняте на основі сучасних даних. Основна відмінність від американської практики складається у відсутності суспільного обговорення, в об'єднанні в одному органі представників уряду, приватного сектора і вчених і в тому, що рішення може бути змінене в світлі подальших наукових відкриттів. У цей час як мінімум сім країн Європи заснували комітети по генной інженерії. Канадська Медична дослідницька рада дотримується постанов Національного інституту здоров'я, але приділяє особливу увагу вірусам і клітинним культурам ссавців.

Генетично модифіковані організми

Питання суспільного впливу на генетику і регулювання наукових досліджень в цій області, багато в чому не вирішені досі. По мірі вдосконалення мікробіологічних технологій і методів з'являються всі нові і нові мотиви для неспокою. У цей час мова вже йде не про те, щоб додати декілька нових генів лабораторним бактеріям. У наш час цілком доступною стала технологія створення з комерційною метою генетично модифікованих організмів, тобто трансгенных рослин і тварин із заданими ознаками. Багато які трансгенные організми досі містяться в лабораторіях для тестування, але деякі вже випущені на ринок. Трансгенные технології стали черговим мотивом для жарких суперечок, оскільки тут зійшлися інтереси отримання вигоди і збереження навколишнього середовища і здоров'я людей. Питання зводиться до того, наскільки безпечно впроваджувати в організм чужу ДНК і наскільки далеко можна передбачувати результати такого впровадження. Останні десять із зайвим років, протягом яких генетично модифіковані продукти використовувалися досить широко, довели, що ці технології не такі уже нешкідливі. Наприклад, в деяких випадках інсулін, отриманий від трансгенных бактерій, призводив до несприятливих наслідків. Однак і особливо небезпечних ситуацій ще не виникало. Національний інститут здоров'я переглянув деякі свої рекомендації, і тепер генетики можуть користуватися значною свободою в своїх експериментах, хоч найбільш небезпечні з них як і раніше знаходяться під контролем. Питання з приводу модифікованих організмів залишаються, і варто згадати хоч би деякі з них.

Першими генетично модифікованими організмами були бактерії центрів кристалізації льоду і помідори сорту Flavrsaver, виведені ще в 1970-х роках. Бактерії призначалися для того, щоб після розпилення на рослинах вони утворювали центри кристалізації льоду; таким чином можна було б трохи підвищити стійкість сільськогосподарських культур до холоду і збільшити період зростання. Помідори повинні були дозрівати пізніше звичайного, щоб довше зберігатися на складі. Планувалося також зменшення відходів через пом'яті і дуже м'які примірники. Після бучливих протестів громадськості розведення цих організмів заборонили.

Багато які генетики сприйняли шум навколо модифікованих продуктів як свого роду бурю в склянці води, і, дійсно, за першими протестами пішло декілька відносно спокійних років. Але дві події показали, що деякі представники громадськості настроєні різко проти впровадження досягнень сучасної генетики в повсякденне життя. Спочатку в 1993 році хтось по прізвиську Унабомбер (пізніше з'ясувалося, що його справжнє ім'я Теодор Качинськи) послав поштою бомбу ведучому американському генетику Чарльзу Епштейну в знак протесту проти «нової генетики». Цей інцидент отримав широке освітлення в пресі. Пізніше, в 1996 році, багато які газети і журнали обійшли фотографії, на яких члени організації «Грінпіс» протестують проти генетично модифікованих продуктів. Це було задоволене серйозний, добре організований захід з сотнями учасників на надувних човнах «Зодіак» і великими плакатами з написом «Зупинимо генетичне забруднення». Своєю мішенню «гринписовцы» вибрали вантажні судна, що доставляли трансгенную сою з Північної Америки в Європу. Для ванкуверских генетиков (таких, як А. Гріффіте і Д. Сузуки, авторів цієї книги) ця подія стала справді двійчастим потрясінням, оскільки організація «Грінпіс», що спочатку боролася з китобійним промислом і випробуваннями ядерної зброї, зародилася саме в Ванкувере. Яким же ударом було взнати, що в розряд своїх ворогів вона включила і «злих генетиков»! За останні декілька років лихоманка протесту розповсюдилася швидкими темпами і охопила весь цивілізований світ. Численні демонстрації проти генетично модифікованих продуктів стали звичайним явищем; рішуче настроєні члени радикальних угруповань виражають свою громадянську непокору тим, що знищують трансгенные рослини і навіть намагаються зруйнувати фабрики по їх виробництву і наукові центри. Недавно вийшов номер журналу «Економіст», на обкладинці якого була зображена жахлива картоплина «Франкенфуд», що вигукує: «Хто боїться ГМ-їжі?» (ГМ - генетично модифікований продукт). У той же час і надії вчених на те, що за допомогою генетично модифікованих продуктів вдасться нагодувати бідні країни і вирішити проблему голоду, також не збулися. Про це ми поговоримо далі.

Технології в контексті Одна з сторін виниклої проблеми - наукова освіта. Як жартують агенти по продажу нерухомості, три ключових елементи, що допомагають продати будинок, - це його місце, місце і ще раз місце. Точно так само і в науковій освіті основні три моменти - це контекст, контекст і ще раз контекст. Без знання контексту всі нові відкриття вчених подібні повітряним кулям - красивим, але нічого що не означає для іншого людства. Неприйняття досягнень сучасної генетики багато в чому корінити в тому, що невідомий контекст їх застосування, і тому ми повинні для почала розглянути нові генетичні технології в світлі технології взагалі.

У всякій технології є свої позитивні і негативні сторони. Багато які погодяться з тим, що промислова революція XIX віку, заснована на наукових досягненнях в області фізики і хімії, підвищила рівень життя в індустріально розвинених країнах. Однак зворотна сторона прогресу в наяности. Наприклад, промислова революція подарувала людству двигун внутрішнього згоряння, за допомогою якого пересуваються автомобілі і інші машини. Автомобіль люди люблять за швидкість, за те, що в ньому легко переміщатися у видалені місця, але при цьому він наносить великий збиток навколишньому середовищу і здоров'ю людей своїми вихлопними газами, не говорячи вже про те, що для виробництва автомобілів добують в шахтах метали, викачують з надр землі нафту; для будівництва шосе вирубує ліси, зменшуючи тим самим біологічну різноманітність. З розвитком транспортної мережі міста зростають і ще більш зменшують площу незайманих дільниць природи. Тільки в одній Канаді щорічно біля 16 тис. смертей відносять на рахунок забруднення атмосфери транспортними засобами. До цієї кількості треба додати тисячі тих, хто гине в автомобільних аваріях. І ці смерті реальні, а не гіпотетичні. Хоч всі трагічні випадки близько зачіпають членів сім'ї загиблих, суспільство відноситься до них поблажливо і вважає неминучою платою за ті блага, які приніс двигун внутрішнього згоряння.

Хімічна промисловість також виробляє величезні забруднення. Хімічна революція минулого віку (Хімія, що проходила під лозунгом «дасть нам кращі речі для більшого комфорту») подарувала нам пластмаси, синтетичні барвники і багато які інші корисні матеріали. Але вона ж стала причиною харчових отруєнь інсектицидами, дір в озоновому шарі, забруднення водоймищ, радіоактивних відходів і тисяч отруйних відстійників по всьому світу. Хімічна промисловість несе відповідальність не тільки за багато які хвороби людей, але і за загибель незліченних рослин і тварин в природних екосистемах.

Генетично модифіковані організми потрібно розглядати в такому ж контексті. Звісно, ніхто не сперечається з тим, що сучасна біотехнологія має свої негативні сторони з соціальної, екологічної і медичної точок зору, навіть якщо досі практично не було повідомлень про захворювання, викликані споживанням модифікованих продуктів. Але потенційну шкоду будь-якої технології треба розглядати разом з потенційним благом від її застосування, і в цьому відношенні генетичні технології стоять врівень з іншими технологіями.

Сучасні дискусії з приводу застосування генетичних технологій потрібно вести з урахуванням досвіду минулого і використання в майбутньому будь-яких технологій. Людство вже досить помилялося в минулому, час навчитися обережності. Такий основний принцип обережності: при умові вибору тактики і при обмежених можливостях передбачувати наслідки, діяти так, щоб заподіяти мінімум шкоди, і так, щоб будь-який крок був оборотний. У будь-якому випадку не треба приймати важливих рішень, поки не будуть ретельно розглянуті всі сторони проекту. Така тактика заснована на тому, що в минулому вже приймалися безвідповідальні рішення про використання нових технологій, що не мають прецедентів, а можливість перенести гени з одного організму в інший дійсно не має прецедентів. Коли виявилося, що ДДТ може вбивати комах, то за допомогою цієї речовини сподівалися назавжди покінчити з шкідниками. У 1948 році його Пауль Мюллер, що відкрив отримав Нобелівську премію. І хоч генетики розуміли, що відбір резистентных мутантів неминучий, а екологи знали, що шкідливі комахи являють собою лише невелику частину всіх комах, широке застосування інсектициду здавалося цілком прийнятним способом контролю над віковими ворогами полів. Ніхто і не передбачав, що ДДТ і інші химикаты розповсюдяться в природі настільки, що увійдуть в харчові ланцюги. Химикаты нагромаджуються в жировій тканині і разом з їжею переходять в організм інших тварин. У процесі биомагнификации концентрація цих речовин збільшується в тисячі, і навіть сотні тисяч разів, досягаючи критичного рівня в скорлуповых залозах птахів і молочних залозах жінок. Цей феномен виявили тільки після того, як почали зникати багато які хижаки. Ніякі запобіжні засоби не допомагали запобігти так непередбаченій небезпеці. Не було можливості передбачувати наслідки застосування і хлорфторуглеродов, які в перший час називали чудом сучасної хімії. Ці речовини хімічно інертні і служать прекрасними переносчиками хімічних речовин в аерозольних балончиках. Ніхто не знав, що хлорфторуглероды будуть нагромаджуватися у верхніх шарах атмосфери і вільні радикали хлора почнуть руйнувати озоновий шар. Природа революційних технологій така, що ми не можемо передбачити всіх наслідків їх використання.

Висновок

Генетична інженерія, а зокрема робота з рекомбинантными ДНК на сьогоднішній день є найважливішою і складовою частиною біотехнології, що найбільш швидко розвивається. Методи генной інженерії перетворюють клітки бактерій, дріжджів і ссавців в "фабрики" для масштабного виробництва будь-якого білка. Це дає можливість детально аналізувати структуру і функції білків і використати їх як лікарські засоби. У цей час кишкова паличка (E. coli) стала постачальником таких важливих гормонів як інсулін і соматотропин. Раніше інсулін отримували з кліток підшлункової залоза тварин, тому вартість його була дуже висока. Для отримання 100 г кристалічного інсуліну потрібно 800-1000 кг підшлункові залози, а одна залоза корови важить 200 - 250 грам. Це робило інсулін дорогим і важкодоступним для широкого кола диабетиков. У 1978 році дослідники з компанії "Генентек" уперше отримали інсулін в спеціально сконструйованому штамі кишкової палички. Інсулін складається з двох полипептидных ланцюгів А і В довжиною 20 і 30 амінокислот. При з'єднанні їх дисульфидными зв'язками утвориться нативный двухцепочечный інсулін. Було показано, що він не містить білків E. coli, эндотоксинов і інших домішок, не дає побічних ефектів, як інсулін тварин, а по біологічній активності від нього не відрізняється. Згодом в клітках E. coli був здійснений синтез проинсулина, для чого на матриці РНК з допомогою зворотної транскриптазы синтезували її ДНК-копію. Після очищення отриманого проинсулина його розщепнули і отримали нативный інсулін, при цьому етапи екстракції і виділення гормону були зведені до мінімуму. З 1000 літрів культуральної рідини можна отримувати до 200 грамів гормону, що еквівалентно кількості інсуліну, що виділяється з 1600 кг підшлункової залоза свині або корови.

Соматотропин - гормон зростання людини, секретируемый гіпофізом. Нестача цього гормону приводить до гипофизарной карликовости. Якщо вводити соматотропин в дозах 10 мг на кг ваги три рази в тиждень, то за рік дитина, страждаюча від його недоліку, може підрости на 6 див. Раніше його отримували з трупного матеріалу, з одного трупа: 4 - 6 мг соматотропина в перерахунку на кінцевий фармацевтичний препарат. Таким чином, доступні кількості гормону були обмежені, крім того, гормон, що отримується цим способом, був неоднорідний і міг містити віруси, що повільно розвиваються. Компанія "Genentec" в 1980 році розробила технологію виробництва соматотропина за допомогою бактерій, який був позбавлений перерахованих недоліків. У 1982 році гормон зростання людини був отриманий в культурі E. coli і тваринних кліток в інституті Пастера у Франції, а з 1984 року почате промислове виробництво інсуліну і в СРСР. При виробництві интерферона використовують як E. coli, S. cerevisae (дріжджі), так і культуру фибробластов або трансформованих лейкоцитів. Аналогічними методами отримують також безпечні і дешеві вакцини.

На технології рекомбинантных ДНК засноване отримання высокоспецифичных ДНК-зондів, за допомогою яких вивчають експресію генів в тканинах, локалізацію генів в хромосомах, виявляють гени, що володіють родинними функціями (наприклад, у людини і курки). ДНК-зонди також використовуються в діагностиці різних захворювань.

Технологія рекомбинантных ДНК зробила можливою нетрадиційний підхід "белок-ген", що отримав назву "зворотна генетика". При такому підході з клітки виділяють білок, клонують ген цього білка, модифікують його, створюючи мутантный ген, що кодує змінену форму білка. Отриманий ген вводять в клітку. Якщо він экспрессируется, несуча його клітка і її нащадки будуть синтезувати змінений білок. Таким чином можна виправляти дефектні гени і лікувати спадкові захворювання.

Якщо гібридну ДНК ввести в запліднене яйцеклетку, можуть бути отримані трансгенные організми, экспрессирующие мутантный ген і що передають його нащадками. Генетична трансформація тварин дозволяє встановити роль окремих генів і їх білкових продуктів як в регуляции активності інших генів, так і при різних патологічних процесах. За допомогою генетичної інженерії створені лінії тварин, стійких до вірусних захворювань, а також породи тварин з корисними для людини ознаками. Наприклад, микроиңекция рекомбинантной ДНК, що містила ген соматотропина бика в зиготу кролика дозволила отримати трансгенное тварина з гиперпродукцией цього гормону. Отримані тварини володіли яскраво вираженої акромегалией.

Зараз навіть важко передбачити всі можливості, які будуть реалізовані в найближчі декілька десятків років.

Список літератури

1. Баурин В.В., Мірошніченко О.И., Захарченко В.И. і інш. // Генноинженерные сільськогосподарські тварини, Москва, 1995, з. 154-165.

2. Бондарук В.В., Захарченко В.И., Беляева Р.Х. і інш. // Генноинженерные сільськогосподарські тварини, Москва, 1995, з. 138-153.

3. Брем Г., Зіновьева Н., Ернст Л.К. // С. біологія, 1993, № 6, з. 3-27.

4. Брем Г., Кройсліх Х., Штранцингер Г. Експеріментальная генетика в тваринництві // М.: РАСХН, 1995, 326 з.

5. Васильев И.М., Шихов И.Я., Некрасов А.А. і інш. // Доповіді АН СРСР, 1989, № 1, з. 206-209.

6. Гольдман И.Л., Башкеєв Е.Д., Гогольовський П.А. і інш. // Доповіді РАСХН, 1992, № 9-10, з. 25-30.

7. Гольдман И.Л., Разін С.В., Ернст Л.К. і інш. // Біотехнологія, 1994, № 2, з. 3-12

8. Ениколопов Г.Н., Захарченко В.И., Гращук М.А. і інш. // Доповіді АН СРСР, 1988, т. 299, № 5, з. 1246-1249.

9. Зеленина И.А., Семенова М.Л., Алімов А.А. і інш. // Генетика, 1991, Т. 27, № 12, з. 2182-2186.

10. Зіновьева Н.А. // Автореф. докт. дисс.: Дубровицы, 1998, 36 з.

11. Зиновьева Н., Безенфельдер У., Мюллер С. і інш.// Біотехнологія, 1998а, № 1, з. 3-11

12. Зиновьева Н., Безенфельдер У., Мюллер С. і інш.// С. біологія, 1998б, № 6, з. 31-34.

13. Зиновьева Н., Безенфельдер У., Мюллер М. // Біотехнологія, 1998в, 4, 17-31.

14. Зиновьева Н.А., Ернст Л.К., Брем Г. Трансгенние тварини і можливості їх використання: молекулярно-генетичні аспекти трансгенеза в тваринництві // Дубровіци, 2000, 128 з.

15. Кузнецова И.В., Ковалів А.В., Сигаєва В.А. і інш. // Біотехнологія, 1993, т. 11-12, с.2-5.

16. Ларионов О., Добровольський В., Лагутін О. // «Нові напрями біотехнології», Пущино, 1994, 127.

17. Козикова Л.В., Медведев С.Ю., Булла Й. І інш. // «Біотехнологія в рослинництві, тваринництві і ветеринарії», Москва, 2001, з. 160-161.

18. Колесников В.А., Алімов А.А., Бармінцев В.А. і інш. // Генетика, 1990; Т. 26, № 12, з. 2122-2126.

19. Колесников В.А., Зеленіна И.А., Семенова М.Л. і інш. // Онтогенез, Т. 26, № 6, 467-480.

20. Ковалів А.В., Кузнецова И.В. // Онтогенез, 1995, Т.26, № 4, з. 300-309.

21. Кузнецова И.В., Ковалів А.В., Сигаєва В.А. і інш. // Біотехнологія, 1993, № 11-12, з. 2-5.

22. Кузнецова И.В., Щит І.Ю.; Ковалів А.В. // С. біологія, 1998; № 6, з. 40-44.

23. Мирошниченко О.И., Захарченко В.И., Прокофьев М.И. і інш. // Доповіді ВАСХНИЛ, 1988, № 5, з. 31-32.

24. Прокофьев М.И., Ларіонов О.А., Мезіна М.Н. і інш. // «ДНК-технології в клітинній інженерії і маркіруванні ознак сільськогосподарських тварин», Дубровіци, 2001, з. 114-115.

25. Розенкрантц А.А., Ячменев С.В., Собольов А.С. // Доповіді АН СРСР, 1990, Т. 312, № 2, з. 493-494.

26. Рядчиков В.Г., Солодухина Л.И., Соколів Н.В. і інш. // Генноинженерные сільськогосподарські тварини, Москва, 1995, з. 73-84.

27. Савченкова І., Зіновьева Н., Булла Й. і інш. // Успіхи совр. біологія, 1996, 116 (1), 78-91.

28. Титова В.А., Зіновьева Н.А., Савченкова И.П. і інш. // Доповіді РАСХН, 2001, № 6, з. 29-31.

29. Чистяков Д.А., Захарченко В.И., Мезіна М.Н. і інш. // Генноинженерные сільськогосподарські тварини, Москва, 1995, з. 127-137.

30. Шафен Р.А., Зеленіна И.А., Семенова М.Л. і інш. // Онтогенез, 2000, Т. 31, № 5, з. 388-394.

31. Эрнст Л.К. // Сільськогосподарська біологія, 1987, № 11, з. 11-17.

32. Эрнст Л.К. Проблеми селекції і біотехнології сільськогосподарських тварин // Москва, 1995, 359 з.

33. Эрнст Л.К. Генная інженерія - важливий чинник селекції сільськогосподарських тварин // «ДНК-технології в клітинній інженерії і маркіруванні ознак сільськогосподарських тварин», Дубровіци, 2001, з. 7-18.

34. Эрнст Л.К., Георгія Г.П., Ениколопов Г.Н. // Вісник с. науки, 1987, № 9, з. 68-73.

35. Эрнст Л.К., Гольдман И.Л., Кадулін С.Г. // Біотехнологія, 1993, № 5, з. 2-14.

36. Эрнст Л.К., Брем Г., Махаєв Е.А. // Генноїнженерние сільськогосподарські тварини, Москва, 1995а, с.48-53.

37. Эрнст Л., Гольдман І., Зіновьева Н. і інш.// Доповіді РАН, 1995б, 345 (4), 555-558.

38. Эрнст Л.К., Гольдман И.Л., Семенова В.А. і інш. // Вівчарство, 1991, № 5, з. 14-16.

39. Эрнст Л.К., Гольдман И.Л., Семенова В.А. і інш. // Доповіді ВАСХНИЛ, 1990, № 6.

40. Эрнст Л.К., Кузін Б.А., Ениколопов Г.Н. і інш. // Доповіді ВАСХНИЛ, 1989, № 9, з. 45-49.
Скелет людини
БАШКИРСЬКА ДЕРЖАВНИЙ педогогіческого УНІВЕРСИТЕТ ІНСТИТУТ ПЕДАГОГІКИ Реферат З дисципліни: основи анатомії, фізіології та гігієни людини. На тему: «Скелет людини» Виконав: Перевірив: Уфа 2007 Зміст 1. Структура і функції скелета 3 2. Будова і форма кісток скелета 6 3. Хребетний стовп 7 4. Грудна

Системи живого світу
РЕФЕРАТ по дисципліні «Природознавство» по темі: «Системи живого світу» Зміст Введення 1. Сучасні підходи до побудови системи живого світу 2. Класична система живого світу Висновок Список використаної літератури Введення Як і всі в природі, живі організми складаються з молекул і атомів, але

Система органів травлення
Федеральне агентство за освітою Державна освітня установа вищої професійної освіти «Далекосхідний державний гуманітарний університет» (ГОУ ВПО ДВГГУ). РЕФЕРАТ ПО АНАТОМІЇ ЛЮДИНИ. ТЕМА: «СИСТЕМА ОРГАНІВ ТРАВЛЕННЯ». Виконала: студентка гр. 523 Шунк Марина Перевірила: доцент кафедри зоології

Синергетика - основа високих соціальних технологій
Зміст Введення Основна частина Висновок Список використаної літератури Введення Тема нашої роботи пов'язана з впливом синергетики на сучасні високі соціальні технології. Синергетика - це міждисциплінарний напрям наукових досліджень, задачею якого є вивчення природних явищ і процесів на основі

Симпатична і парасимпатическая нервові системи
Реферат на тему: «Симпатична і парасимпатическая нервові системи» План Вегетативна (автономна) нервова система Мимовільно керовані функції Синоптична передача в симпатичних ганглиях М-струми у вегетативних ганглиях Література Вегетативна (автономна) нервова система Вегетативна (автономна)

Сердечнососудистая система
Зміст Вступ 1. Серце людини 2. Захворювання серця і їх лікування 3. Кров: її склад і значення для організму 4. Загальна схема кровоснабжения Висновок Список літератури Вступ Для нормальної життєдіяльності всі органи людини, і їх клітки повинні постійно отримувати кисень і живлячі речовини.

Свобода волі людини: Мартин Лютер проти Еразма Роттердамського»
Контрольна робота по дисципліні: АНТРОПОЛОГІЯ Тема № 8 «Свобода волі людини: Мартин Лютер проти Еразма Роттердамського» Дата здачі в деканат_ 2006 План контрольної роботи: Вступ...3 1. Поняття свободи волі людини... 5 2. Свобода волі людини по Біблії...10 3. М. Лютер проти Е. Роттердамського...11

© 2014-2022  8ref.com - українські реферати