трусики женские украина

На головну

Процессинг РНК. Теломеры і теломераза - Біологія

ЛЕКЦІЯ

ПРОЦЕССИНГ РНК Процессинг РНК у эукариот

Отже у эукариотов первинний «транскрипт» з ДНК значно більше, ніж зріла РНК. Поряд з «учасниками рибонуклеотидной послідовності, що означають» транскрипта, так званими «экзонами», які увійдуть в готову молекулу РНК, в ньому є і зайві, «дільниці, що мовчать» - «интроны», належні видаленню (прозрачка 18). Помітимо, що у эукариотов співвідношення интроны/экзоны (по довжині) дорівнює 9:1. Для прокариотов -співвідношення зворотне, 1:9.

Все интроны транскрибируются в складі РНК-попередника і згодом віддаляються в процесі розриву-возз'єднання - сплайсинга. Сплайсинг відбувається ще в ядрі, перед виходом РНК в цитоплазму. При цьому повинна бути збережена (або встановлена) правильна рамка лічення. Явище сплайсинга у эукариотов не дозволяє по амінокислотній послідовності білка відновити послідовність нуклеотидов в кодуючій його дільниці ДНК. У прокариотов, на щастя, явище сплайсинга спостерігається рідко, і відповідність послідовностей РНК і ДНК, як правило, зберігається.

Виділяють чотири вигляду интронов, і, відповідно, чотири механізми сплайсинга

Види интронов

1) Интроны генів ядерних мРНК.

Першими були виявлені интроны в ядерних генах, що кодують білки. Їх розмір варіює від 100 п.н. до 10 т.п. н. і більш. Найбільш характерною відмітною рисою всіх цих интронов є наявність специфічних послідовностей поблизу їх 5'- (лівої, або донорной) і 3'-(правий, або акцепторной) кінців (тобто на стиках интронов і экзонов або в сайтах сплайсинга).

Нуклеотидные послідовності в місцях з'єднання экзонов і интронов вельми консервативні і практично однакові у всіх генах ядерних мРНК майже у всіх вивчених видів (прозрачка 20). 5'-сайт сплайсинга частіше за все фланкирует послідовність ЦRГ (де R - пурин), а 3'-сайт - всього один залишок Г. проте послідовності фланкирующие интроны ззовні можуть значно варіювати, а мутації в них ніколи не запобігають сплайсинг, хоч і можуть впливати на його швидкість. Першими двома нуклеотидами на 5'-кінці интрона в РНК майже завжди є ГУ (виключення, ГЦ, зустрічається усього в двох випадках); наступні чотири нуклеотида можуть трохи варіювати, але, мабуть, канонічною є послідовність АГАГУ. Заміна залишку Г або У в місці зчленування звичайно блокує сплайсинг, а заміна сусідніх основ впливає на сплайсинг по-різному. Вказані шість нуклеотидов на 5'-кінці интрона і визначають специфічну функцію 5'-сайта сплайсинга. На 3'-кінці интрона завжди знаходиться пара АГ. Мутації, що приводять до заміни константних А і Г на інші основи, також блокують сплайсинг в цьому сайте.

Залишок А поблизу 3'-кінця интрона грає важливу роль в сплайсинге ядерних промРНК. У интронах ссавцях цей залишок не знаходиться в фіксованому положенні або в якій небудь певній послідовності, оскільки його роль ймовірно, може грати будь-який з декількох залишків А, розташованих на дільниці від 18 до 37 нуклеотида перед 3'-сайтом сплайсинга. Однак мутації, які зачіпають сусідствувати з вказаним залишком А послідовності, приводять до істотного зменшення ефективність сплайсинга in vitro; отже, хоч цей залишок і не належить якійсь певній послідовності його оточення влияеть на сплайсинг.

У интронах можуть міститися різні генетичні елементи, наприклад энхансеры, інші гени, можливо, сигнали реплікації і упаковки хромосоми або послідовності, необхідні для упаковки промРНК в рибонуклеотидные частинки.

Сплайсинг ядерної про мРНК.

Сплайсинг ядерної про мРНК здійснюється в ядрі, можливо, одночасно з транскрипцією для одних генів, і лише після завершення транскрипції для інших.

Цис-сплайсинг. Першим етапом сплайсинга є зборка комплексу сплайсинга. Самі ранні продукти, ті, що виявляються в процесі сплайсинга in vitro утворяться внаслідок точного розщеплення в 5'-сайте сплайсинга один з них містить 5'-экзон, а інший - интрон і 3'-экзон (прозрачка 22). Розщеплення в 5'-сайте повинно передувати розщепленню в 3'-сайте. У ході реакції нагромаджуються два продукти: правильне лигированные экзоны і вільний цілий интрон. Як продукт початкового розщеплення, так і вирізаний интрон містять структури типу ласо.

Вирізуванню интрона в формі ласо і лигированию двох экзонов для сплайсинга ядерних про мРНК потрібно безліч ядерних чинників-білків і рибонуклеопротеидных комплексів (мяРНП). Комплекс, що складається з безлічі субъединиц, який катализирует сплайсинг, називають сплайсингосомой. Сплайсингосома складається з интрона, пов'язаного щонайменше з п'ятьма різними мяРНП і деякими допоміжними білками, звичайно не пов'язаними з цими мяРНП. Сплайсингосомы утворяться шляхом спаровування молекул РНК, приєднання білків до РНК і скріплення цих білків один з одним (прозрачка 23). Кінцевий результат сплайсинга у випадку про мРНК: интрон вирізається, а фланкирующих його экзона сполучаються.

Транс-сплайсинг. Досі, говорячи об сплайсинге, ми розглядали внутрішньомолекулярний, або цис-реакції. А чи існує міжмолекулярний або транс-сплайсинг? Інакшими словами, чи може відбуватися легування двох экзонов, що знаходяться в різних молекулах РНК, з одночасним видаленням фланкирующих їх интронов? Транс-сплайсинг є важливим етапом внутрішньоклітинної освіти всіх мРНК у Tripanosoma (прозрачка 25). Крім того, можливість міжмолекулярного сплайсинга продемонстрована в дослідах in vitro (прозрачка 24).

2) Интроны в генах тРНК. Розмір интронов в генах тРНК коливається від 14 до приблизно 60 нуклеотидов, але вони локалізуються завжди в одному і тому ж місці: через один нуклеотид від 3'-кінця антикодона (прозрачка 26). Як правило, якщо ген даної тРНК має интрон, то всі інші гени в межах вигляду кодуючі цю тРНК також містять такий же интрон. Однак у генів, що кодують різні тРНК внутрішня і флангова дільниці интронов помітно розрізнюються. Встановлено, що видалення интрона гена супрессора тРНКтир за допомогою направленого мутагенезу не впливає на здібність до експресії при введенні в клітки. І все ж, весмотря на те, що ця тРНК транскрибируется і процессируется нормальне, залишок У в антикодоне не модифікується як звичайно з освітою ψ. Чи Є це вказівкою на роль интронов в посттранскрипционной модифікації тРНК або ми маємо справу з унікальною властивістю тРНКтир - не ясно.

Сплайсинг тРНК. Механізм видалення интронов в тРНК краще усього вивчений у дріжджів, але деяка інформація є в дослідах з іншими нижчими эукариотами і рослинами.

Задача складається в тому, що треба вирізати интрон в антикодоновой петлі. У дріжджів (прозрачка 26) тут включаються специфічні ферменти - эндонуклеазы, які взнають ці послідовності і розщеплюють про-тРНК в обох сайтах сплайсинга з утворенням вказаних кінців, полифункциональный білок, який катализирует всі реакції крім фосфатазной, 2'фосфатазы, лигазы і АТФ (в цьому випадку в місці зчленування обох экзонов знаходиться фосфатна група, яка до цього була кінцевим фосфатом АТФ). У хребетних (прозрачка 27) три вказані реакції катализируют окремі ферменти. При цьому кожний фермент бере участь тільки в сплайсинге тРНК. Відмітимо, що фосфат в місці з'єднання двох экзонов раніше знаходився в місці зчленування экзона і интрона.

3) Особливі типи интронов: група Подібні интроны виявлені в багатьох генах, але жоден з них не був виявлений в генах хребетних.

Интроны групи I відрізняються один від одного по розміру, вони мають ряд загальних властивостей:

А) вони самі катализируют свій сплайсинг, який може протікати in vitro у відсутності яких-би те не було білків;

Б) інформація, необхідна для сплайсинга, міститься у безлічі відносно коротких внутрішніх послідовностей всередині интрона, які забезпечують укладання молекули з утворенням характерної просторової структури.

У) сплайсинг ініціюється вільним гуанозином або будь-яким з його 5'-фосфорелированных похідних

Г) кінцевими продуктами сплайсинга є рРНК і лінійна РНК, розмір яких декілька менше, ніж розмір интрона.

Самосплайсинг интронов групи I. про-рРНК, прототип интрона групи I здійснюється за участю послідовних реакцій трансэтерификации, в яких акти фосфодиэфирного обміну не супроводяться гидролизом. (прозрачка 28).

4) Особливі типи интронов: група II.

Интроны групи II поширені менш широко. Вони виявлені в двох митохондриальных генах дріжджів, що кодують одну з субъединиц цитохромоксидазы і цитихром b; цікаво, що в цих генах присутні також интроны групи

Интроны групи II також зазнають самосплайсингу in vitro, але в цьому випадку реакція ініціюється не экзогенным гуанозином, а залишком вхідним до складу самого интрона (прозрачка 29) Інтрони групи II, вивільнені після сплайсинга являють собою лассоподобные структури, в яких 5'-кінцевий фосфат РНК интрона сполучений фосфодиэфирной зв'язком з 2'-гидроксильной групою внутрішнього нуклеотида.

Альтернативний сплайсинг

При сплайсинге більшій частині про-мРНК кожний интрон вирізається у відповідних 5'-і 3' -сайтах сплайсинга. У результаті все экзоны і порядок їх розташування в транскрипте зберігаються в зрілої мРНК і утворять безперервну послідовність (сплайсинг, що конституює ). Однак сплайсинг деяких про-мРНК протікає по-різному з утворенням сімейства близьких по будові мРНК, кожна з яких складається з специфічного набору экзонов і кодує одну з изоформ білків одного сімейства. Такий спосіб процессинга РНК називається альтернативним сплайсингом (прозрачка 30). Зростає число генів з різних організмів, від Drosophila до людини і їх вірусів, про які відомо, що при дозріванні їх про-мРНК використовується альтернативний сплайсинг. Ці гени кодують багато які білки, в тому числі деякі білки, що беруть участь в формуванні цитоскелета, мышечном скороченні, зборці мембранных рецепторов, пептидных гормонів, в проміжному метаболізмі і транспозиции ДНК (переміщення деяких сегментів ДНК в інші геномные локусы).

ЛЕКЦІЯ

ТЕЛОМЕРЫ І ТЕЛОМЕРАЗА. РИБОЗИМЫ.

ЗВОРОТНА ТРАНСКРИПЦІЯ

За допомогою методу культивування кліток тварин і рослин in vitro клітки самих різноманітних тканин людини можна вирощувати на спеціально підібраних живлячих середах, подібно бактеріям або іншим одноклітинним організмам. Безліч клітинних культур людини спочатку отримана з кліток ракових пухлин. Ці клітки можуть ділитися в культурі необмежене число разів (тому їх називають безсмертними, або иммортализованными). Біологи довгий час перебували в упевненості, що в оптимальних умовах нескінченно довго можуть ділитися і нормальні клітки людини і тварин (як в культурі, так і в організмі).

Однак на початку 1960-х років Леонард Хейфлік встановив, що в клітинних культурах нормальні диплоидные (соматичні) клітки людини здатні ділитися лише обмежене число разів. При цьому граничне число делений (Обмеження на число клітинних делений і називають лімітом Хейфліка.) сильно залежить від віку індивідуума, якому ці клітки спочатку належали. Так, клітки, які брали у новонароджених, ділилися в культурі 80-90 разів, а у 70-літньої людини - тільки 20-30 разів. Досягши "ліміту Хейфліка", клітки переходять в стан одряхления (яке в англомовній, а тепер часто і в російській літературі називається сенесенсом, senescence), який характеризується різкою зміною метаболізму, і насамперед порушенням реплікації ДНК. Услід за цим станом звичайно слідує загибель кліток.

У січні 1998 року засоби масової інформації у всьому світі буквально вибухнули повідомленнями про те, що групі американських вчених вдалося примусити нормальні клітки людини подолати "ліміт Хейфліка" майже вдвоє. Замість того щоб постаріти і померти, клітки продовжували ділитися і виглядали юними. При цьому перетворення їх в ракові клітки (тобто злоякісної трансформації) не відбувалося: по всіх ознаках клітки, що втратили здатність старіти, були нормальними. У газетах негайно з'явилися статті із заголовками на зразок "Генетики утикалися в безсмертя", "Ліки від старіння будуть доступні, як аспірин", "Таблетки від старості стають реальністю" і т.п.

Що ж сталося насправді? Вчені з лабораторій Джеррі Шейя, Вудрінга Райта, працюючі під патронажем фірми "Джерон корпорейшн" ( "Geron Corporation"), за допомогою витончених генетичних маніпуляцій примусили в нормальних клітках людини працювати фермент теломеразу, активність якої до цього була нульовою. Теломераза бере участь в утворенні теломер-спеціальних структур, розташованих на кінцях лінійних хромосом эукариот. Таким чином, оновлення теломер і стало причиною порятунку кліток від одряхления.

ТЕЛОМЕРЫ

Теломеры - це

- специализованные кінцеві райони лінійної хромосомної ДНК,

- складаються з коротких нуклеотидных послідовностей, що багато разів повторюються.

- В склад теломер входять також багато які білки, що специфічно зв'язуються з теломерными ДНК-повторами.

- Таким чином, теломеры (так само, як і всі інші райони хромосоми эукариот) побудовані з дезоксинуклеопротеидов (ДНП), тобто комплексів ДНК з білками.

- Існування таких дільниць було постулировано в 1938 році класиками генетики, лауреатами Нобелівської премії Барбарой Мак-Клинток і Германом Меллером. Незалежно один від одного вони виявили, що фрагментація хромосом (під дією рентгенівського опромінювання) і поява у них додаткових кінців ведуть до хромосомних перебудов і деградації хромосом. У збереженні залишалися лише області хромосом, прилеглі до їх природних кінців. Позбавлені кінцевих теломер, хромосоми починають зливатися з великою частотою, що веде до важких генетичних аномалій.

- вони уклали, що природні кінці лінійних хромосом захищені спеціальними структурами. Г. Меллер запропонував називати їх теломерами (від греч. телос - кінець і мерос - частина).

- В подальші роки з'ясувалося, що теломеры не тільки запобігають деградації і злиттю хромосом (і тим самим підтримують цілісність генома господарської клітки),

- але і, мабуть, відповідальні за прикріплення хромосом до спеціальної внутриядерной структури (своєрідному скелету клітинного ядра), званої ядерним матриксом (мал. 1).

- Таким чином, теломеры грають важливу роль в створенні специфічної архітектури і внутрішньої впорядкованості клітинного ядра. Більш того ми покажемо, що наявність на кінцях хромосом спеціальної теломерной ДНК дозволяє вирішити так звану проблему кінцевий недорепликации ДНК.

- Першими об'єктами дослідження були одноклітинні найпростіші (ресничная інфузорія тетрахимена, зокрема ), оскільки через особливості будови ядерного і хромосомного апарату вони містять декілька десятків тисяч дуже дрібних хромосом і, отже, безліч теломер в одній клітці (для порівняння: у вищих эукариот на клітку доводиться менш ста теломер).

Блоки, що Багато разів повторюються в теломерной ДНК найпростіших складаються усього лише з шести-восьми нуклеотидных залишків. При цьому один ланцюг ДНК сильно збагачений залишками гуаниловой кислоти (G-багатий ланцюг; у тетрахимены вона побудована з блоків TTGGGG), а комплементарная їй ланцюг ДНК відповідно збагачена залишками цитидиловой кислоти (З-багатий ланцюг).

У дріжджів блоки, що повторюються в теломерной ДНК помітно довше, ніж у найпростіших, і часто не так регулярні.

По-якому ж було здивування вчених, коли виявилося, що теломерная ДНК людини побудована з TTAGGG-блоків, тобто відрізняється від найпростіших усього лише однією буквою в повторі. Більш того з TTAGGG-блоків побудовані теломерные ДНК (вірніше, їх G-багаті ланцюги) всіх ссавців, рептилій, амфібій, птахів і риб. Так же універсальний теломерный ДНК-повтор у рослин: не тільки у всіх наземних рослин, але навіть у їх вельми віддалених родичів - морських водоростей він представлений послідовністю TTTAGGG. Проте, дивуватися тут особливо чомусь, оскільки

-в теломерной ДНК не закодовано ніяких білків (вона не містить генів), а у всіх організмів теломеры виконують універсальні функції, мова про яких йшла вище. Правда, як це часто буває в живій природі, з цього загального правила є рідкі, але важливі виключення. Найбільш відоме з них - теломерная ДНК плодової мухи дрозофилы. Вона представлена не короткими повторами, а ретротранспозонами - жвавими генетичними елементами (детальніше про жваві генетичні елементи і роль ретротранспозонов в освіті теломер див. в статтях "В.М. Глазера Гомологичная генетична рекомбінація" і "Генетична рекомбінація без гомологии: процеси, ведучі до перебудов в геноме" і В.А. Гвоздева "Жвава ДНК эукариот. Ч. 1-2" в "Соросовськом Освітньому Журналі" (1998. № 7, 8).

- Дуже важлива характеристика теломерных ДНК - їх довжина. У людини вона коливається від 2 до 20 тис. пар основ (т.п. про.), а у деяких видів мишей може досягати сотень т.п. про.

- Було помічено, що у багатьох видів двуспиральная теломерная ДНК на самому кінці містить однотяжевой "хвіст". Цей однотяжевой район теломерной ДНК представлений її G-багатим ланцюгом і закінчується вільною 3'-гидроксильной групою. Відповідно білки теломер прийнято поділяти на дві групи: білки, які пов'язані з однотяжевой теломерной ДНК, і білки, пов'язані з двутяжевой ДНК теломеры. Ці білки вивчаються вельми інтенсивно, але знаємо ми про них ще мало. Немає сумнівів в тому, що теломерные білки беруть участь у всіх функціях теломер, підтримуючи їх структуру і регулюючи довжину теломерной ДНК (як ми побачимо нижче, довжина теломер - надзвичайно важливий параметр). Встановлено, що деякі з білків, асоційованих з двуспиральной теломерной ДНК, регулюють активність певних генів, підвищуючи або придушуючи їх експресію. Як приклад можна привести дрожжевой білок Rap1p. Цей ДНК-зв'язуючий білок, безсумнівно, бере участь в регуляции довжини теломерной ДНК. У той же час, навіть будучи в складі теломеры, він бере участь в активації і репресії транскрипції. Це означає, що зміни або порушення в структурі теломер можуть зачіпати не тільки їх власні функції, але і експресію життєво важливих генів, що знаходяться в інших районах хромосом. Крім того, важливі для підтримки загальної структури хромосом білки розташовуються на ДНК, що безпосередньо примикає до теломерной (іноді її називають субтеломерной ДНК).

Відомо, що ДНК-полимеразы, синтезуючи дочірній ланцюг ДНК, прочитують батьківський ланцюг в напрямі від її 3'-кінця до 5'-кінця. Відповідно дочірній ланцюг синтезується в напрямі 5' 3'. У протилежному напрямі синтез ланцюга ДНК фермент катализировать не може (мал. 2). Крім того, ДНК-полимераза починає синтез тільки зі спеціального РНК-праймера - короткої РНК-затравка, комплементарной ДНК. Після закінчення синтезу ДНК РНК-праймеры віддаляються, а пропуски в одному з дочірніх ланцюгів ДНК заповнюються ДНК-полимеразой. Однак на 3'-кінці ДНК такий пропуск заповнений бути не може, і тому 3'-кінцеві дільниці ДНК залишаються однотяжевыми, а їх 5'-кінцеві дільниці - недореплицированными. Звідси ясно, що кожний раунд реплікації хромосом буде приводити до їх укорочению. Зрозуміло, що передусім повинна скорочуватися довжина теломерной ДНК.

У 1984 році Е. Блекберн і Е. Грайдер виділили фермент, який за допомогою механізму, відмінного від механізму реакцій, лежачих в основі реплікації ДНК, синтезує теломерную ДНК. Цей фермент був названий теломеразой.

ЯК ПРАЦЮЄ ТЕЛОМЕРАЗА

Теломераза - це фермент‚ що синтезує сегменти, що тандемно повторюються ДНК, з яких складається G-ланцюг теломерной ДНК.

- вона відноситься до класу ДНК-полимераз

- теломераза - це РНК-залежна ДНК-полимераза або зворотна транскриптаза.

- Ферменти цього класу, синтезуючі ДНК на РНК-матрицях, дуже добре відомі молекулярним біологам. Вони закодовані і містяться в ретровирусах (наприклад, у вірусі імунодефіциту людини, зухвалому захворювання СПІДом) і служать для синтезу ДНК-списів їх геномов, який в ретровирусе представлений РНК.

- В клітинному геноме зворотні транскриптазы закодовані в ретротранспозонах.

- РНК, що використовується теломеразой для синтезу теломерной ДНК як матриця, входить до складу цього ферменту. У цьому унікальність теломеразы: на сьогодні це єдина відома РНК-вмісна зворотна транскриптаза.

- Теломеразные РНК у різних організмів сильно розрізнюються по довжині і структурі.

- Теломеразы найпростіших містять РНК довжиною в 150-200 нуклеотидных залишків (н.о.),

- довжина теломеразной РНК людини - 450 н.о.,

- теломераза дріжджів містить аномально довгу РНК (біля 1300 н.о.).

- Як і будь-яка інша РНК клітки, теломеразная РНК володіє специфічною повторною і третинною структурою. Повторна структура ізольованої теломеразной РНК достовірно встановлена тільки для теломераз найпростіших. Просторова структура теломеразной РНК в складі ферментативного комплексу поки ще невідома.

- Матрична дільниця представлена в теломеразной РНК тільки один раз. Його довжина не перевищує довжину двох повторів в теломерной ДНК, які він кодує і яким він, зрозуміло, комплементарен.

- Оскільки теломераза синтезує сегменти ДНК, що повторюються багато разів, використовуючи тільки один сегмент своєї РНК, вона повинна володіти здатністю періодично (після завершення синтезу кожного повтору) переміщувати (транслоцировать) матричну дільницю в район 3'-кінця теломерной, що синтезується ДНК. Джерелом енергії для такого переміщення, мабуть, служить сама реакція синтезу ланцюга теломерной ДНК, оскільки дезоксинуклеозидтрифосфаты - субстрат цієї реакції - высокоэнергетические речовини.

Таке подовження можливе, тому що кінці хромосом містять повтори з декількох нуклеотидов (наприклад, у людини ТТАGGG), яким комплементарен дільниця РНК - компонента теломеразы. Таким чином, теломераза взнає виступаючий 3'-кінець і подовжує його. У такому випадку вдається, знов з використанням ДНК-затравка і РНК-матриці, добудувати кінець ДНК (див. мал. 3). Теломеразная машина влаштована таким чином, що кінець хромосоми може не тільки зберігатися, але і довшати серед поколінь. Дійсно, останнє неважке собі представити, якщо 3'-кінець, що добудовується буде досить довгим. Одна з причин старіння бачиться в тому, що при відсутності теломеразы в деяких тканинах відбувається укорочення хромосоми з втратою важливих генів. Навпаки, безсмертя ряду кліток в культурі поза організмом, властиве, як правило, кліткам з пухлин, пояснюється реактивацией теломеразы. Ми стисло розглянули цю цікаву проблему, пов'язану з активністю теломеразы і вічними проблемами біологічного старіння і опухолевого зростання, оскільки виявилося, що іноді в боротьбу з укорочением кінців хромосом вступають мобільні елементи. У плодової мушки дрозофилы відсутній теломеразная машина, але кінці ДНК довшають за рахунок переміщень ретротранспозонов. На цьому прикладі уперше показана важлива структурна і функціональна роль ретротранспозонов. Вони виступають як компоненти генома, що спасають хромосому від укорочення. Як рятівники виступають ретротранспозоны, що відносяться до сімейств, без довгих кінцевих повторів. Ретротранспозоны переміщаються, утворюючи структуру, що повторюється, в якій елементи сполучені один з одним по типу "голова до хвоста" (див. мал. 3). Спочатку на РНК-транскрипте як на матриці з допомогою ревертазы будується комплементарная нитка ДНК, а потім після видалення РНК-матриці добудовується інша. Таким чином, якщо ці ретротранспозоны і існували колись як елементи-паразити, то згодом геном господаря пристосував їх для виконання так важливої функції, як збереження кінцевих дільниць хромосом. Ці ретротранспозоны стали вже не егоїстами, а безцінними помічниками, що спасають хромосому від втрати генів.

1. На першій стадії теломераза знаходить 3'-кінець теломерной ДНК, з яким частина матричної дільниці теломеразной РНК утворить комплементарный комплекс. При цьому теломераза використовує 3'-кінець хромосомної ДНК в якості праймера.

2. Далі наступає черга РНК-залежної ДНК-полимеразной активності теломеразы. Вона забезпечується спеціальної субъединицей теломеразы, яка по пристрою свого каталітичного центра багато в чому схожа із зворотними транскриптазами ретровирусов і ретротранспозонов.

3. Коли синтез ДНК-повтору закінчується, відбувається транслокация, тобто переміщення матриці і білкових субъединиц ферменту на наново синтезований кінець теломерной ДНК, і весь цикл повторюється знову.

Знайомство навіть з вельми схематичным описом механізму теломеразной реакції (див. мал. 3) приводить до висновку, що двома компонентами - зворотної транскриптазой і теломеразной РНК - для її здійснення обійтися не можна.

Немає сумнівів в тому, що в його складі повинні бути субъединица, що відповідає за пошук і скріплення 3'-кінця хромосоми (і що виконує таким чином своєрідну якірну функцію); субъединица, відповідальна за транслокацию; субъединицы, зв'язуючі продукт реакції (однотяжевую ДНК). У складі теломеразы звичайно виявляється і білкова субъединица з нуклеазной активністю, яка, мабуть, отщепляет від 3'-кінця теломерной ДНК один за іншим декілька нуклеотидов доти, поки на цьому кінці не виявиться послідовність, комплементарная потрібній дільниці матричного сегмента теломеразной РНК. Ці субъединицы теломеразы, що виконують різноманітні функції в ході синтезу G-ланцюга теломерной ДНК, зображені на мал. 4, на якому приведена гіпотетична структура теломеразы дріжджів. Треба ще раз підкреслити, що повний білковий склад ферменту не відомий досі ні в одному випадку. Тому в табл. 1 приведені характеристики тільки добре вивчених білкових субъединиц декількох теломераз.

Широке поширення теломераз серед эукариот говорить про те, що механізм синтезу теломерной ДНК, який ми спостерігаємо у сучасних організмів, виник дуже давно. Більш того еволюційно-генетичний порівняльний аналіз нуклеотидных послідовностей генів каталітичних субъединиц теломераз і інші зворотні транскриптаз показує, що цей механізм міг існувати ще до появи перших эукариотических кліток.

З-ланцюг теломерной ДНК синтезується з допомогою звичайної ДНК-полимеразы (див. мал. 2). Тому 3'-кінцева дільниця G-ланцюга, на якій, мабуть, спочатку була РНК-затравка, в кінцевому результаті залишається в однотяжевом стані (тобто в принципі він готовий до того, щоб теломераза наростила на ньому новий повтор).

Активність теломеразы у вищих эукариот виявлена лише в трьох типах кліток:

- генеративных,

- ракових

- лініях иммортализованных клітинних культур.

статевих і стволовых клітках. У інших типах кліток синтез цього ферменту припиняється ще в ембріональний період розвитку

В організмі при дифференцировке кліток теломераза репресується. Експресію теломеразы вважають чинником иммортализации кліток.

У соматичних клітках, що культивуються in vitro, теломераза не працює і теломеры поступово скорочуються. Довжина теломер достовірно коррелирует з пролиферативным потенціалом (наприклад, в фибробластах людину). Укорочение теломер може грати роль митотических годин, що відлічують число делений клітки. По досягненні критичної довжини теломерной ДНК запускаються процеси зупинки клітинного циклу [5]. Блок клітинних делений наступає ще до того, як теломера зникла зовсім. Існує деяка мінімальна довжина теломеры, коли ділення ще дозволене. Інакшими словами, припинення ділення наступає до того, як почав руйнуватися смисловий текст генома. Таким способом эукариоты страхують себе від появи монстрів внаслідок недорепликации ДНК.

Опублікована в 1998 році в журналі "Science" стаття американських дослідників завдяки засобам масової інформації привернула увагу не тільки вчених (а насамперед не вчених) в зв'язку з проблемами старіння і "клітинного безсмертя". У цій прекрасній роботі колективу, очолюваного Джеррі Шеєм, вдалося на 40% збільшити число делений нормальних соматичних кліток людини в культурі. За допомогою генно-інженерних методів в клітки був введений ген каталітичної білкової субъединицы теломеразы і прилегла до нього дільниця ДНК, регулюючий його роботу. При активній роботі гена збільшувався як розмір теломерной ДНК, так і тривалість життя клітинних культур. Зверх звичайних 50 делений клітки пройшли додатково 20 делений.

Укорочение теломер можна розглядати як молекулярний індикатор кількості делений, але не старіння клітки. Так, на культурі нормальних фибробластов людини, взятих від донорів у віці від 0 до 93 років, виявили кореляцію між початковою довжиною теломер і пролиферативной здатністю клітки у всьому діапазоні віку. А розмір теломерной ДНК сперматозоидов не меншав відповідно до віку чоловіка, що говорить про експресію теломеразы в лінії статевих кліток. Припинення роботи теломеразы, що відмічається в переважній більшості диференційованих соматичних кліток тваринних, є свідченням їх зрілості, а отже, і неминуче наступних потім процесів в'янення і загибелі.

Старіння особня - це нормальна біологічна функція, сприяюча прогресивній еволюції вигляду, що розмножується статевим шляхом. Тиск природного відбору слабшає після досягнення твариною репродуктивного успіху, оскільки існування особня після цього має менше значення для вигляду. Смерть від старості видаляє з популяції предків, що виконала свою роль і дає простір нащадкам - носіям нових корисних ознак. Як будь-яка важлива біологічна функція, старіння зумовлене паралельною дією декількох молекулярних механізмів [6]. Вимкнення теломеразы - лише одне з них.

Не варто розглядати гени, що кодують білкові субъединицы теломеразы і вхідну в її склад РНК, як "гени безсмертя". Підтримка довжини теломерной ДНК на певному рівні залежить не тільки від взаємодії з нею теломеразы і теломерсвязывающих білків, але і деяких, поки невідомих чинників, регулюючих утворення самих компонентів теломеробразующего комплексу.

Навряд чи безсмертя, досягнуте раковими клітками, що розмножуються в культурі десятиріччями без укорочения теломер, - це те, до чого треба прагнути. Ліків від смерті немає. Але той факт, що введення в такі клітки препаратів, зв'язуючих РНК-компонент теломеразы, приводить до укорочению теломер з подальшою загибеллю кліток, вселяє надію на появу нових коштів боротьби з раком.

Розуміння механізму роботи теломеразы, а головне, регуляции експресії її в клітці наблизить нас до розуміння процесів і злоякісної трансформації і старіння.

ТЕЛОМЕРАЗА, РАК І СТАРІННЯ

Питання про те, в якій мірі теломерный механізм бере участь в старінні багатоклітинних організмів. Цілком можливо, що вони винайшли зовсім інакші програми старечого феноптоза. Однак безсумнівно, що у людей - рекордсменів по долгожительству зменшення довжини теломер вже наближається до тієї фатальної межі, за якою наступає заборона на розмноження кліток. Так, за даними групи К. Сасаджіми з Японії, теломеры в клітках печінки стариків старше за 80 років виявляються майже вдвоє коротшим, ніж у дітей до 8 років. Мабуть, продовжити життя тим, кому за 100, можна лише при умові, що вдасться наростити їх теломеры, включивши на якийсь час теломеразу в печінці і інших тканинах, де цей фермент вимкнувся ще під час ембріонального розвитку.

Розглянемо дані про довжину теломерной ДНК і активність теломеразы в різних клітках людини, приведені в табл. 2.

Висока теломеразная активність спостерігається в статевих клітках людини протягом всього його життя. Відповідно їх теломеры складаються з найбільшого числа ДНК-повторів і містять всі необхідні білки для нормальної пролиферации кліток. Аналогічна ситуація спостерігається і для стволовых кліток. Нагадаємо, що стволовые клітки діляться необмежено довго. Однак у стволовой клітки завжди є можливість дати дві дочірні клітки, одна з яких залишиться стволовой ( "безсмертної"), а інша вступить в процес дифференцировки. Завдяки цьому стволовые клітки служать постійним джерелом різноманітних кліток організму. Наприклад, стволовые клітки кісткового мозку дають початок гемопоэзу - процесу утворення кліток крові, а з базальных кліток эпидермиса відбуваються різноманітні клітки шкіряного покривала. Як тільки нащадки статевих або стволовых кліток починають диференціюватися, активність теломеразы падає і їх теломеры починають скорочуватися. У клітках, дифференцировка яких завершена, активність теломеразы падає до нуля, і, як ми вже відмічали, з кожним клітинним діленням вони з неминучістю наближаються до стану сенесенса (перестають ділитися). Услід за цим наступає криза, і більшість кліток гинуть (мал. 5). Ця картина характерна для переважної більшості відомих культур кліток эукариот. Однак і тут є рідкі, але важливі виключення: теломеразная активність виявляється в таких "смертних" клітках, як макрофаги і лейкоцити.

Недавно було встановлено, що нормальні соматичні клітки тому позбавлені теломеразной активності, що в них повністю пригнічена експресія гена її каталітичної субъединицы (зворотної транскриптазы). Інші ж становлячі теломеразы, включаючи теломеразную РНК, утворяться в цих клітках, хоч і в менших кількостях, ніж в їх "безсмертних" прародителях, але постійно (або, як говорять, конституювати). Відкриття цього важливого факту Дж. Шеем, В. Райтом і їх співробітниками і стало основою для тієї сенсаційної роботи по подоланню "ліміту Хейфліка". Дійсно, все інше було вже справою техніки (хоч і дуже непростої).

У нормальні соматичні клітки були внесені гени теломеразной зворотної транскриптазы за допомогою спеціальних векторів, сконструйованих з вірусних ДНК. Рівень експресії гена в эукариотической клітці залежить від багатьох чинників, в тому числі від білків - чинників транскрипції, що зв'язуються зі спеціалізованими дільницями ДНК, розташованими в хромосомі по сусідству з цим геном. Геномы вірусів, яким треба швидко розмножитися в клітці-господарі, несуть в собі дільниці ДНК, здатні у багато разів посилити експресію того або інакшого гена. Дослідники потурбувалися про те, щоб в їх конструкціях ген теломеразной зворотної транскриптазы людини виявився в оточенні саме таких дільниць вірусної ДНК. Результати їх експериментів можна підсумовувати стисло: клітки, в яких теломераза підтримувала довжину теломер на рівні, характерному для молодих кліток, продовжували ділитися і тоді, коли контрольні клітки (без теломеразы) старіли і вмирали.

У цій і аналогічній їй роботах особливо ретельно контролюється відсутність в культурі кліток ракових кліток. Відомо, що клітки більшості досліджених на сьогодні ракових пухлин характеризуються досить високою активністю теломеразы, яка підтримує довжину теломер на постійному рівні (див. табл. 2). Цей рівень помітно нижче, ніж, наприклад, у ембріональних кліток, але він достатній, щоб забезпечити безмежне ділення ракових кліток в культурі. Існує гіпотеза, у якої немало прихильників, що передбачає, що втрата теломеразной активності соматичними клітками сучасних організмів є благоприобретенное в процесі еволюції властивість, що уберігає їх від злоякісного переродження.

Порівняно невелика довжина теломер у більшості ракових кліток наводить на думку про те, що вони відбуваються з нормальних кліток, що досягли предкризисного стану. Як ми вже відмічали, цей стан характеризується порушенням регуляции багатьох біохімічних реакцій. У таких клітках відбуваються численні хромосомні перебудови, які в тому числі ведуть і до злоякісної трансформації (більш детально про походження злоякісних пухлин див. в статті Г.І. Абельова "Що таке пухлина": Соросовский Освітній Журнал. 1997. № 10). Більшість цих кліток гинуть, але в частині з них внаслідок випадкових мутацій може активуватися постійна експресія генів теломеразы, яка буде підтримувати довжину теломер на рівні, необхідному і достатньому для їх функціонування (див. мал. 5).

Деякий час викликав здивування той факт, що приблизно п'ята частина проаналізованих ракових пухлин і кліток взагалі не містила активної теломеразы. Виявилося, однак, що довжина теломер в них підтримується на належному рівні. Таким чином, в цих клітках діє інший (не теломеразный, а швидше рекомбінаційний) механізм освіти теломерной ДНК (див. статтю "В.М. Глазера Гомологичная генетична рекомбінація": Соросовский Освітній Журнал. 1998. № 7). Інакшими словами, такі клітки знаходяться в тому ж ряду виключень з правила, що і дрозофила.

ЗАМІСТЬ ВИСНОВКУ

Які ж практичні висновки виходять з того, що на сьогоднішній день вдалося дізнатися про зв'язок між активністю теломеразы, раковим зростанням і старінням кліток. Здавалося б, вони лежать на поверхні: не хочеш старіти - активуй теломеразу; хочеш убити ракову пухлину - убий в ній спочатку теломеразу.

Легковесность першого висновку (а саме його підхопили засоби масової інформації) очевидна: між культурою кліток і клітинною тканиною, а тим більше організмом дистанція величезного розміру. Ще не прийшов час всерйоз обговорювати проблему отримання трансгенных органів людини для пересадки їх хворим людям (хоч теоретично це, звісно, можливо). А головне, процес старіння не тільки організму, але і клітки - це виключно складний комплекс змін у безлічі біохімічних реакцій, і його навряд чи можна повернути назад, впливаючи тільки на якусь одну з них. У той же час існують цілком реальні плани активувати теломеразу в клітках шкіри, яку пересаджують пацієнтам з сильними опіками, і тим самим активувати їх зростання. Або спробувати тим же шляхом "омолодити" клітки сітчатки ока, взявши їх у пацієнта, страждаючого помутнінням сітчатки (а це широко поширене захворювання у немолодих людей, ведуче до сліпоти), і потім повернути назад.

Що ж до розробки методів виборчого придушення теломеразной активності в ракових пухлинах, то зараз цей важливий напрям в пошуку нових коштів боротьби зі злоякісними захворюваннями. Поки більшість робіт пов'язана з випробуванням ингибиторов зворотних транскриптаз (каталітичних субъединиц теломераз). Досвід боротьби з СПІДом, де намагаються вирішити аналогічну задачу, говорить про те, що певні надії знайти такі ліки є. Головна трудність полягає в тому, що каталітична субъединица теломеразы - це одна з ДНК-полимераз і шуканий ингибитор повинен бути направлений саме на теломеразную ДНК-синтезуючу активність. У іншому випадку він буде токсичний для нормальних кліток.

Більш перспективними здаються роботи, що недавно з'явилися, в яких описане виборче придушення теломеразной РНК, зухвале загибель ракових кліток в культурі. У нормальних клітках, як це ми відмічали вище, теломеразная РНК синтезується, але ці клітки позбавлені теломеразной активності і, швидше усього, теломеразная РНК ним не потрібна.

Вивчення тонкої структури теломер і механізму дії теломераз перебуває ще тільки в початковій стадії. Однак вони залучають до себе величезний інтерес дослідників, працюючих в самих різних областях біології і медицини, і тут вже найближчим часом можна чекати нових цікавих відкриттів.

Авіація і космонавтика
Автоматизація та управління
Архітектура
Астрологія
Астрономія
Банківська справа
Безпека життєдіяльності
Біографії
Біологія
Біологія і хімія
Біржова справа
Ботаніка та сільське господарство
Валютні відносини
Ветеринарія
Військова кафедра
Географія
Геодезія
Геологія
Діловодство
Гроші та кредит
Природознавство
Журналістика
Зарубіжна література
Зоологія
Видавнича справа та поліграфія
Інвестиції
Інформатика
Історія
Історія техніки
Комунікації і зв'язок
Косметологія
Короткий зміст творів
Криміналістика
Кримінологія
Криптологія
Кулінарія
Культура і мистецтво
Культурологія
Логіка
Логістика
Маркетинг
Математика
Медицина, здоров'я
Медичні науки
Менеджмент
Металургія
Музика
Наука і техніка
Нарисна геометрія
Фільми онлайн
Педагогіка
Підприємництво
Промисловість, виробництво
Психологія
Психологія, педагогіка
Радіоелектроніка
Реклама
Релігія і міфологія
Риторика
Різне
Сексологія
Соціологія
Статистика
Страхування
Будівельні науки
Будівництво
Схемотехніка
Теорія організації
Теплотехніка
Технологія
Товарознавство
Транспорт
Туризм
Управління
Керуючі науки
Фізика
Фізкультура і спорт
Філософія
Фінансові науки
Фінанси
Фотографія
Хімія
Цифрові пристрої
Екологія
Економіка
Економіко-математичне моделювання
Економічна географія
Економічна теорія
Етика

8ref.com

© 8ref.com - українські реферати


енциклопедія  бефстроганов  рагу  оселедець  солянка