трусики женские украина

На головну

 Продукти рекомбінації: характеристика і маніпулювання - Біологія

Продукти рекомбінації: характеристика і маніпулювання

Після відбору клонованих рекомбінантних молекул потрібно охарактеризувати міститься в них вставку. Для цього необхідно відповісти на кілька запитань. Насамперед - чи дійсно рекомбінантна молекула містить потрібний сегмент ДНК? Далі - включився чи сегмент цілком або тільки частково? Чи відповідає він у всіх деталях геномної ДНК, з якої відбувається? Чи є потрібна послідовність функціональної? Ми розглянемо різні підходи до характеризації клонованих фрагментів ДНК. Насамперед потрібно очистити рекомбинантную ДНК від ДНК клітин господаря, РНК і білків. Ця процедура досить проста і включає екстракцію, фізичне розділення компонентів і ферментативне розщеплення РНК і білків. Так, плазмідну ДНК можна відокремити від геномної завдяки її малому розміру і кільцевої структурі. Фагів ДНК можна отримати у вільному від клітинної ДНК вигляді шляхом очищення фагових частинок і наступного виділення з них ДНК.макроструктура клонованої вставки

Для визначення макроструктури вставки спочатку встановлюють її розмір і положення сайтів для рестріктірующіх ендонуклеаз. Оскільки клоновані фрагменти геномної ДНК часто бувають довше або коротше, ніж цікавить нас область, необхідно також визначити положення і довжину потрібного сегмента всередині вставки.

а. Розмір вставки

Розмір векторної молекули зазвичай буває відомий, тому розмір вставки можна оцінити, знаючи повну довжину рекомбінантної молекули і припустивши, що ніякого делетірованія під час клонування не відбулося. Розмір багатьох рекомбінантних молекул можна визначити за допомогою гель-електрофорезу. Щоб отримати точні дані, кільцеві рекомбінантні молекули перетворюють на лінійні, оскільки електрофоретична рухливість кільцевих структур залежить від ступеня їх сверхспіральності. Стандартні електрофоретичні методи непридатні для тестування молекул, довжина яких перевищує 15 т.п. н, оскільки великі молекули мігрують в гелі занадто повільно. Тому розмір багатьох рекомбінантних молекул не піддається прямому визначенню за допомогою електрофорезу, якщо тільки не використовується імпульсний електрофорез. Альтернативний спосіб оцінки розміру рекомбінантних молекул полягає у вимірюванні їх довжини за допомогою електронної мікроскопії. Тут теж дуже важливі стандартні розміри, оскільки число пар основ в сегменті певної довжини на електронній мікрофотографії може залежати від конфігурації молекули і способу приготування препарату.

Інший підхід до визначення розміру вставки полягає в зверненні тих реакцій, які використовувалися при конструюванні рекомбінантних молекул, тобто в вирізання вставок за допомогою відповідних ендонуклеаз рестрикції. Розмір лінійної вставки визначають за допомогою гель-електрофорезу. Оскільки карта сайтів для ендонуклеаз рестрикції у векторній молекулі зазвичай буває відома, ідентифікувати вбудований фрагмент досить легко. Якщо при лигирование відбулася елімінація ендонуклеазних сайтів на кінцях вставки, можна використовувати альтернативну процедуру: розрізати векторну молекулу по сайтам, які знаходяться в ділянках, які фланкируют вставку; в цьому випадку вставка буде вирізана разом з сегментами вектора відомих розмірів. Іноді ситуація ускладнюється тим, що сама вставка містить сайти впізнавання для використовуваної ендонуклеази. У такому випадку сума розмірів всіх фрагментів, що утворюються з вставки, дасть її загальну довжину. Якщо вставка занадто велика, то її розрізання і підсумовування можуть виявитися навіть необхідними для більш точного визначення довжини.

б. Картування сайтів для рестріктірующіх ендонуклеаз

У тих випадках, коли вектор має невеликі розміри і не занадто складний, положення сайтів іноді можна визначити безпосередньо в самій рекомбінантної молекулі. Однак часто виявляється необхідним спочатку вирізати вставку і очистити її від векторних сегментів.

в. Субклонірованіе

Довгі клоновані вставки, що входять до складу Х - або космідного вектора, часто бувають дуже незручними для маніпулювання. Тому після побудови часткової рестрикційної карти вставку можна розділити на більш дрібні фрагменти шляхом субклонірованія. В принципі субклонірованіе не відрізняється від інших методів створення рекомбінантних ДНК, просто в цих випадках в якості вихідного геному використовують рекомбінантний клон. Для субклонірованія зазвичай застосовують рестріктірующіе ендонуклеази, сайти впізнавання яких складаються з чотирьох пар основ, оскільки вони здатні розрізати ДНК в багатьох місцях.

м Визначення положення даного нас сегмента у вставці

Для визначення положення сегментів в невеликих рекомбінантних геномах використовуються ті ж підходи, що і при знаходженні специфічних сегментів у великих геномах до клонування. Після побудови рестрикційної карти вставки встановити точну локалізацію потрібного сегмента не складає труднощів. Для цього потрібен тільки відповідний мічений зонд, аналогічний ДНК - або РНК-зонду, використовуваному для відбору клону на початку клонування.

Овальбумін-це білок, що складається з одного поліпептидного ланцюга; він синтезується в яйцеводе курки після стимуляції стероїдних гормоном естрогеном і накопичується в яєчному білку. У курей-несучок стимуляція гормоном відбувається в природних умовах, а у курчат освіту яйцевода і синтез овальбуміна індукуються при введенні естрогену. Гормон індукує транскрипцію гена овальбуміна, в результаті чого зміст овальбуміновой мРНК в клітині збільшується практично від нуля до 50000 молекул через два-три тижні і падає до 10 молекул на клітину після припинення впливу естрогену. Яйцепроводи курей-несучок являють собою гарне джерело овальбуміновой мРНК, оскільки вона становить в них близько 50% сумарної мРНК. Очищену мРНК використовують потім для приготування радіоактивного зонда, застосовуваного для ідентифікації клонованого гена овальбуміна. Зондом може служити радіоактивно мічена одноцепочечная кДНК, синтезована безпосередньо на мРНК за допомогою зворотного транскіптази, або клонована дуплексная кДНК. За допомогою таких зондів з популяції Х-векторів, що містять вставки геномної ДНК курки, отримані при обмеженому гідролізі ендонуклеазою EcoRI, були відібрані клоновані послідовності овальбумінового гена. Вставка, мала довжину 6,8 т.п. н. З неї утворилися три EcoRI-фрагмента, при цьому тільки фрагмент довжиною 2,35 т.п. н. отжигать з овальбуміновим кДНК-зондом.

Положення шуканої послідовності в клонованій сегменті можна визначити також за допомогою електронної мікроскопії. Для цього зонд і рекомбінантний ДНК змішують, денатурируют і отжигают, а потім готують препарат для микроскопирования. Комплементарні ділянки зонда і досліджуваної молекули утворюють дуплекси, які на електронних мікрофотографіях виглядають як відносно товсті нитки, а некомплементарни ділянки залишаються одноланцюжковий і мають вигляд більш тонких ниток. Гетеродуплекс, що утворюється між овальбуміновим рекомбінантов формуються за умов, сприятливих для гібридизації типу РНК'ДНК, а не ДНК'ДНК. У сегменті ДНК розміром 2,35 т.п. н., який гібрідізоваться з мРНК, в освіті двухцепочечной структури брали участь тільки близько 550 п. н. Таким чином, гетеродуплексний аналіз набагато більш інформативний, ніж визначення положення кодують послідовностей в клоні. Він показує, що, хоча мРНК містить близько 1800 п. Н., В клонованій сегменті ДНК представлено менше третини довжини кодують послідовностей гена овальбуміна. Крім того, 550 п. Н. в клонованої ДНК, комплементарні мРНК, не утворюють одну безперервну послідовність, а розподілені по чотирьох ділянках, розділеним одноланцюжковий петлями, тобто кодують послідовності геномної ДНК чергуються з некодуючих. Як описано в разд.8.5, такі проміжні послідовності, або інтрони, типові для еукаріотичних генов.Тонкая структура клонованої вставки: нуклеотидних послідовність

Щоб до кінця з'ясувати структуру, функцію і походження клонованого сегмента ДНК, необхідно встановити його первинну структуру - нуклеотидну послідовність. Швидкі і точні методи визначення послідовностей ДНК були створені незабаром після розробки методів, використовуваних в роботі з рекомбінантними молекулами. В принципі зараз можна провести секвенування молекули ДНК будь-якої довжини. Визначення послідовності сегментів ДНК довжиною в сотні і навіть тисячі нуклеотидів являє собою рутинну процедуру, а приблизно до 1975 р це була дуже важке завдання. Для цього за допомогою РНК-полімерази спочатку отримували РНК-копії ДНК, а потім визначали нуклеотидну послідовність кРНК. Точність і повнота процесу копіювання часто були недостатні, а секвенування РНК займало багато часу. Зараз секвеніруют саму ДНК, а для секвенірова-ня РНК зазвичай спочатку отримують кДНК-копії.

а. Загальні принципи

Методи секвенування ДНК можна розбити на дві категорії. В основі одних лежать хімічні реакції, в яких використовуються безпосередньо фрагменти очищеної ДНК. У другому випадку використовують ДНК-копії очищених сегментів, отримані ферментативним шляхом. Ці підходи мають і деяку схожість. Насамперед фрагменти ДНК зазвичай очищають, що легко здійснити за допомогою клонування. Далі, і в тому, і в іншому випадку за один раз секвеніруют тільки один ланцюг ДНК. Для підвищення точності краще провести секвенування кожного ланцюга дуплексной молекули і порівняти результати. За один раз використовують тільки одну з ланцюгів, позначену радіоактивним ізотопом. Визначають нуклеотидну послідовність тільки цього ланцюга, і саме про неї ми будемо говорити в наступних розділах. Третя спільна особливість зазначених методів полягає в тому, що в обох випадках утворюється набір радіоактивно мічених одиночних ланцюгів всіх можливих довжин - від одиниці до п, де п - повна довжина секвенируемой молекули.

В обох підходах, хімічному і ферментативном, повний набір фрагментів насправді буває представлений у вигляді чотирьох окремих наборів. В ідеалі кожен такий набір містить всі можливі фрагменти, що беруть початок на одному кінці ланцюга і продовжуються до чергового місця розташування певного нуклеотиду. Так, один з наборів містить всі можливі ланцюга, що починаються в одному сайті та закінчуються в тих місцях, де зустрічається дезоксиаденозин. Другий набір містить всі можливі ланцюга, що починаються в тому ж сайті, а закінчуються на всіх зустрічаються почергово дезоксіцітідінових залишках. Третій і четвертий набори представлені фрагментами, що закінчуються на залишках тимідину або дезоксигуанозина.

Хімічний і ферментативний методи відрізняються один від одного способом отримання чотирьох наборів фрагментів. У першому випадку цей набір отримують шляхом розрізання попередньо радіоактивно міченої ланцюга чотирма різними способами, а в другому чотири радіоактивно мічених набору фрагментів отримують шляхом копіювання немічених ланцюга ДНК. Останнім етапом в обох методах є поділ фрагментів, що становлять кожен з наборів, по довжинах за допомогою електрофорезу в поліакриламідному гелі в денатуруючих умовах. При цьому вдається розділити полінуклеотидні ланцюга, що відрізняються один від одного тільки одним нуклеотидним залишком. Оскільки фрагменти несуть радіоактивну мітку, їх легко виявити за допомогою радиоавтографии, при цьому досить лише невеликої кількості ДНК - близько пікомоль або навіть менше. Всі чотири набори, отримані з одного фрагмента

ДНК, піддають одночасного електрофорез на паралельних доріжках однієї пластини гелю. Скануючи кожну доріжку, розшифровують всю послідовність. Використовуючи спеціальні електрофоретичні методи, можна розділити ланцюга розміром від 1 до 300 або більше нуклеотидних залишків. Молекули, довжина яких перевищує кілька сотень нуклеотидів, фрагментують і потім визначають нуклеотидну послідовність кожного фрагмента.

б. Хімічне секвенування

Отримання наборів фрагментів, що мають спільні кінці. Хімічне секвенування засноване на специфічній модифікації різних пуринових і піримідинових основ. Ці модифіковані підстави вищепляются потім з полімерної ланцюга із збереженням сахарофосфатний остова. Далі гидролизуют щодо нестабільні фосфодіефірні зв'язку, що є сусідами з сайтом, де знаходилося віддалене модифіковане підставу, в результаті чого ланцюг розривається. Всі ці реакції, де в якості прикладу розглянута модифікація гуанінових залишків. Представлені дві реакції, одна з яких специфічна відносно тільки гуаніну, а інша - тільки цитозину, і дві реакції, специфічні відносно небудь пуринів, або пиримидинов. Кожну з чотирьох реакцій проводять з використанням окремого препарату ДНК, в результаті чого отримують чотири набори фрагментів, необхідних для точного визначення послідовності. Глибина кожної реакції строго обмежена, так що в кожній молекулі ДНК даного препарату в реакцію вступає в середньому тільки одне з чутливих підстав. В результаті популяція ідентичних молекул ДНК перетворюється в ході реакцій, в яких беруть участь випадкові реакційно здатні підстави, в набір ланцюгів, що починаються в даному сайті на одному кінці ланцюга і закінчуються на одному з реакційно здатних підстав. Розрізання ланцюга відбувається тільки по дезоксіцітідіновим залишкам.

Кожна з чотирьох реакційних сумішей насправді представлена ??двома наборами ланцюгів, які утворюються внаслідок гідролізу препарату ДНК. Один включає всі фрагменти, що починаються на 5'-кінці вихідної ланцюга, інший - всі фрагменти, що починаються на 3'-кінці. Потрібну нам інформацію про послідовність можна отримати, використовуючи будь-який з наборів, і вибір одного з них залежить від того, як був позначений вихідний фрагмент - з 3 '- або 5'-кінця - перед проведенням хімічних реакцій, специфічних щодо певного підстави. Немічених матеріал не можна візуалізувати за допомогою радіавтографіі. Якщо вихідним матеріалом є дуплексная ДНК, то позначена повинна бути тільки одна з двох ланцюгів, в іншому випадку кінцеві продукти будуть представлені двома різними наборами мічених ланцюгів і дані буде важко інтерпретувати.

Введення мітки в 5'-кінець здійснюють за допомогою полінуклеотідкінази і у-32Р. Якщо присутні 5'-кінцеві фосфомоноефірние групи, то їх необхідно попередньо видалити за допомогою фосфомоноестерази. Одноцепочечниє молекули секвеніруют відразу після введення мітки. Дуплексную ДНК після здійснення кіназної реакції поділяють на дві комплементарні ланцюга за допомогою денатурації та електрофорезу. Мічений дволанцюжкові фрагмент можна також розрізати на дві частини за певним внутрішнім ендонуклеазному сайту і утворилися фрагменти розділити за допомогою електрофорезу. У цьому випадку секвенируемой молекули насправді є двухцепочечную, але одна з ланцюгів не містить мітки і тому залишається "невидимою".

Введення мітки в 3'-кінці дуплексних ланцюгів доцільно проводити в тому випадку, коли на 5'-кінцях є виступи. Подовження більш коротких 3'-решт каталізується або ДНК-полімеразою I, або зворотного транскриптазою, що використовують виступаючий 5'-кінець як матрицю; 32Р включається в ланцюг у складі відповідного а-32Р-міченого дезоксинуклеозидтрифосфатов. Мічення по -кінцю відбувається в кожній з ланцюгів двухцепочечной ДНК, а для секвенування необхідно мати препарат, в якому всі молекули несуть мітку тільки на одному кінці. Тому мічені дволанцюжкові фрагменти розщеплюють рестриктазой і фракционируют субфрагмента за допомогою гель-електрофорезу або розділяють ланцюга ДНК. Однак, якщо кінці дуплексного фрагмента не ідентичні, часто виявляється можливим пряме отримання одноцепочечного32Р-міченого кінця. Наприклад, якщо один з кінців тупий, то його подовження не відбувається, і при відповідному підборі а-32Р-міченого дезоксинуклеозидтрифосфатов можна помітити тільки один з кінців.

в. Ферментативне секвенування

Отримання наборів фрагментів, що мають спільні кінці. Для секвенування ДНК за допомогою ферментативного копіювання необхідно мати одноцепочечную ДНК, а також короткий полідезоксі-нуклеотідний праймер, комплементарний невеликій ділянці ДНК. Одиночна ланцюг служить матрицею, а нова ланцюг нарощується, починаючи з 3'-гідроксильної групи праймера шляхом приєднання дезоксірібонуклеотідтріфосфатов. При секвенування проводять чотири типи реакцій копіювання, у результаті чого утворюються чотири набори ланцюгів, синтез яких зупинено на залишках А, С, G або Т. Зупинка синтезу відбувається в результаті приєднання дідезоксінуклеотіда, у якого відсутня 3'-гідроксильна група, що перешкоджає подальшому подовженню ланцюга. Реакції проводять таким чином, щоб ймовірність зупинки синтезу на будь-якому іншому залишку, крім заданого, була дуже мала.

ДНК-полімераза I може утилізувати 2 ', 3'-дідезоксінуклео-зідтріфосфатние аналоги нормальних дезоксінуклеозідтріфосфатних субстратів. Як і при звичайній полімеризації, відповідний дідезоксінуклеотід приєднується до 3'-гідроксильної кінця праймерной ланцюга, проте утворюється при цьому продукт не може служити праймером для подальшого росту ланцюга, і реакція зупиняється.

Для проведення чотирьох різних реакцій копіювання комплекс "матриця-праймер" инкубируют в присутності всіх чотирьох звичайних дезоксирибонуклеозидтрифосфатов і якогось певного дідезоксінуклеозідтріфосфата. Наприклад, в одній реакції використовують ddATP, dATP, dGTP, dCTP, dTTP, в іншій - dATP, ddGTP, dGTP, dCTP, dTTP і т.д. Подовження ланцюга за допомогою матричного копіювання відбувається до тих пір, поки замість чергового дезоксинуклеотидов не приєднається дідезоксінуклеотід; в цей момент зростання ланцюга припиняється. Оскільки термінация синтезу відбувається у випадкових сайтах, утворюється набір ланцюгів всіх можливих довжин, починаючи з 5'-кінця праймера до сайтів, відповідних положенню приєднаного дідезоксінуклеотіда. Новосинтезовані ланцюга є радіоактивно міченими, оскільки в реакції використовується щонайменше один радіоактивно мічений дезоксинуклеозидтрифосфатов. Часто їм є а-32-Р-дезоксинуклеозидтрифосфатов, але це може бути также358 - дезоксинуклеозидтрифосфатов. Іноді використовується радіоактивно мічений праймер. Продукти чотирьох реакцій піддають одночасного електрофорез на окремих доріжках, як при хімічному секвенування. Послідовність зчитують з радіоавтографа, який виглядає так само, як і радіоавтограф, отриманий при використанні хімічного методу секвенування.

Отримання одноцепочечной ДНК для секвенування за допомогою дідезоксітермінаторов. Молекули ДНК зазвичай є двухцепочечную; виняток становлять лише одноцепочечниє ДНК деяких бактеріофагів. Як ми вже говорили, фізичне розділення

Повний текст реферату

Авіація і космонавтика
Автоматизація та управління
Архітектура
Астрологія
Астрономія
Банківська справа
Безпека життєдіяльності
Біографії
Біологія
Біологія і хімія
Біржова справа
Ботаніка та сільське господарство
Валютні відносини
Ветеринарія
Військова кафедра
Географія
Геодезія
Геологія
Діловодство
Гроші та кредит
Природознавство
Журналістика
Зарубіжна література
Зоологія
Видавнича справа та поліграфія
Інвестиції
Інформатика
Історія
Історія техніки
Комунікації і зв'язок
Косметологія
Короткий зміст творів
Криміналістика
Кримінологія
Криптологія
Кулінарія
Культура і мистецтво
Культурологія
Логіка
Логістика
Маркетинг
Математика
Медицина, здоров'я
Медичні науки
Менеджмент
Металургія
Музика
Наука і техніка
Нарисна геометрія
Фільми онлайн
Педагогіка
Підприємництво
Промисловість, виробництво
Психологія
Психологія, педагогіка
Радіоелектроніка
Реклама
Релігія і міфологія
Риторика
Різне
Сексологія
Соціологія
Статистика
Страхування
Будівельні науки
Будівництво
Схемотехніка
Теорія організації
Теплотехніка
Технологія
Товарознавство
Транспорт
Туризм
Управління
Керуючі науки
Фізика
Фізкультура і спорт
Філософія
Фінансові науки
Фінанси
Фотографія
Хімія
Цифрові пристрої
Екологія
Економіка
Економіко-математичне моделювання
Економічна географія
Економічна теорія
Етика

8ref.com

© 8ref.com - українські реферати


енциклопедія  бефстроганов  рагу  оселедець  солянка