трусики женские украина

На головну

 Принципи біохімічних досліджень - Біологія

Зміст

Лекція 1. Обладнання біохімічної лабораторії. Загальні принципи біохімічного дослідження

Лекція 2. Руйнування клітин і екстракція. Центрифугування

Лекція 3. Поділ білків шляхом осадження

Лекція 4. Буферні розчини та спеціальні добавки. Ультрафільтрація. Діаліз. Детергенти та їх застосування

Лекція 5. Загальні принципи хроматографії, класифікація хроматографічних методів

Лекція 6. Матеріали матриць сорбентів і обмінників. Техніка колоночной хроматографії

Лекція 7. Адсорбційна і розподільна хроматографії

Лекція 8. Тонкошарова хроматографія

Лекція 9. Ионообменная хроматографія

Лекція 10. Ионообменная ЖХВД білків. Хроматофокусірованіе

Лекція 11. Афінна хроматографія

Лекція 12. Гель-фільтрація

Лекція 13. Теоретичні та методичні засади електрофорезу

Лекція 14. ізоелектричного фокусування і ізотахофорез

Лекція 15. Виявлення, кількісне визначення і характеристика макромолекул після електрофорезу

Лекція 16. Принцип імунного електрофорезу. Іммунофіксація

Лекція 17. Електросінерез. Електроіммуноаналіз

Лекція 18. Методи мічених атомів

Лекція 19. Спектрофотометричні методи аналізу

Лекція 20. Флюоріметріческіе методи аналізу

Лекція 21. Імуноферментний аналіз

Лекція 22. Радіометричний аналіз. Мас-спектроскопія

Лекція 23. блоттинга-аналіз

Лекція 1. Обладнання біохімічної лабораторії. Загальні принципи біохімічного дослідження

Джерела небезпеки та заходи безпеки в лабораторії при проведенні біохімічного аналізу. Особливості застосування загальних лабораторних методів в біохімічному експерименті. Мікро - і нанометоди.

Лабораторний посуд: матеріали для її виготовлення, вибір оптимального матеріалу залежно від поставленого завдання біохімічного експерименту, види лабораторного посуду, біосумісні способи миття та сушіння лабораторного посуду, особливі способи підготовки лабораторного посуду для біохімічного аналізу.

Вихідні реактиви для біохімічної лабораторії. Відомості про реактивах: маркування реактивів, використання літературних і електронних джерел довідкової інформації. Особливості зберігання реактивів для біохімічного аналізу. Способи перевірки якості і чистоти реактивів, вибір способу перевірки, адекватного поставленої аналітичної задачі. Методи додаткової підготовки та очищення реактивів для біохімічного аналізу. Перекристалізація.

Методи відбору реактивів в біохімічному аналізі. Зважування: види ваг для аналітичної біохімії, принципи і джерела похибок зважування. Дозування рідин, використання піпеточних дозаторів, можливі джерела похибок. Особливості приготування розчинів в аналітичній біохімії: принципи приготування, способи вираження, концентрацій, розчинності, розчинники для біохімічного аналізу, способи поступового додавання реактивів, розчинення погано розчинних речовин (суспендування, емульгування, детергенти, використання яких допустимо в біохімічному аналізі). Буферні розчини для використання в біохімічному аналізі.

Методи контролю температури в біохімічної лабораторній практиці.

Необхідність проведення низки біохімічних аналізів в спеціальних умовах. Техніка робіт з реагентами, чутливими до вологи, кисню повітря і світла. Проведення реакцій в апротонних розчинниках, в безводних умовах і в інертній атмосфері. Техніка проведення фотохімічних реакцій.Лекція 2. Руйнування клітин і екстракція. Центрифугування

Принцип методу, основні визначення та формули. Центрифугування застосовується для розділення неоднорідних рідких середовищ.

Центрифугування дозволяє розділити суміш, що складається з двох або більше компонентів з різною питомою щільністю, якщо принаймні один з цих компонентів - рідина.

Поділ речовин за допомогою центрифугування засноване на різному поведінці частинок у відцентровому полі. У відцентровому полі частинки, що мають різну щільність, форму або розміри, осідають з різною швидкістю.

Швидкість осадження, або седиментації, залежить від відцентрового прискорення (G), прямо пропорційного кутовій швидкості ротора (, в рад / с) і відстані між часткою і віссю обертання (г, в см): G = 2 - м Оскільки один оборот ротора складає 2л радіан, кутову швидкість ротора в оборотах на хвилину (об. / хв) можна записати так: v = 2p?60 (об. / хв), а відцентрове прискорення тоді буде одно: G = 4p2?r / 3600 (об. / хв) 2.

Відцентрове прискорення зазвичай виражається в одиницях g {гравітаційна стала, рівна 980 см * с-1) і називається відносним відцентровим, прискоренням (ОЦУ), тобто ОЦУ = 4p2?r / 3600 * 980 (об. / Хв) 2 або ОЦУ = 1,11 * 10-5 * r (об. / Хв) 2 (*)

На підставі рівняння (*) Доулом та Котціас була складена номограма, що виражає залежність ОЦУ від швидкості обертання ротора і радіуса г - середнього радіусу обертання стовпчика рідини в центрифужной пробірці (тобто відстані від осі обертання до середини стовпчика рідини).

Номограма для розрахунку відцентрового прискорення

Для визначення G з'єднують прямою лінією значення радіусу і швидкості обертання ротора на крайніх шкалах; точка перетину цієї прямої з середньою шкалою дає шукану величину відцентрового прискорення. Слід мати на увазі, що права колонка цифр шкали G відповідає правій колонці цифр шкали швидкості обертання ротора; ліва - лівої.

Швидкість седиментації сферичних частинок залежить не тільки від відцентрового прискорення, але і від щільності і радіусу самих частинок і від в'язкості середовища суспендування. Час осадження сферичної частинки в рідкому середовищі від меніска рідини до дна центрифужной пробірки обернено пропорційно швидкості седиментації і визначається таким рівнянням (закон Стокса, видозмінений Сведбергом і Нікольса):

де t - час седиментації, с; h - в'язкість середовища, Паскаль - секунда; ГЧ - радіус частинки, см; рч - щільність частки (питома вага); p - щільність середовища (рідини) або питома вага; гм - відстань від осі обертання до меніска рідини, см; гд - відстань від осі обертання до дна пробірки, див.

Як випливає з рівняння (**), при заданій швидкості обертання ротора час, необхідний для осадження гомогенних сферичних частинок, обернено пропорційно квадрату їх радіусів і різниці щільності частинок і середовища і прямо пропорційно в'язкості середовища. Тому суміш гетерогенних, приблизно сферичних частинок, що розрізняються по щільності і (або) розмірам, можна виділити або за рахунок різного часу осадження їх на дно пробірки при даному прискоренні, або за рахунок розподілу седіментірующіх частинок вздовж пробірки, що встановлюється через певний проміжок часу. При поділі речовин необхідно враховувати і такі важливі фактори, як щільність і в'язкість середовища.

Описаними методами можна виділяти клітинні органели з гомогенатов тканин. Основні компоненти клітини осідають в наступній послідовності: спочатку цілі клітини і їх фрагменти, потім ядра, хлоропласти, мітохондрії, лізосоми (або інші мікротільця), мікросоми (фрагменти гладкою і шорсткою ендоплазматичної мережі) і, нарешті, рибосоми.

Осадження несферичних часток не підпорядковується рівнянню (**), тому частинки однакової маси, але різної форми осідають при різних швидкостях. Ця особливість використовується при дослідженні конформації макромолекул.

Препаративне центрифугування полягає у виділенні біологічного матеріалу для подальших біохімічних досліджень.

За допомогою препаративного центрифугування виділяють велику кількість клітинних частинок для вивчення їх морфології, структури і біологічної активності. Метод застосовується для виділення таких біологічних макромолекул, як ДНК і білки, з попередньо очищених препаратів.

Аналітичне центрифугування застосовується головним чином для вивчення чистих і практично чистих препаратів макромолекул або частинок, наприклад, рибосом. У даному випадку використовується невелика кількість матеріалу, а седиментация досліджуваних частинок безперервно реєструється за допомогою спеціальних оптичних систем. Метод дозволяє отримувати дані про чистоту, молекулярній масі і структурі матеріалу.

У практиці препаративні центрифугування застосовується набагато частіше, ніж аналітичне, тому ми зупинимося на ньому більш докладно, хоча в основі обох методів лежать загальні прінціпи.Лекція 3. Поділ білків шляхом осадження

Осадження нуклеїнових кислот.

Зазвичай, коли говорять про Висолювання, мають на увазі висолювання саме сульфатом амонію. Цьому методу вже більше 130 років. Раніше він застосовувався і для фракціонування, зараз, в основному, як дешевий і зручний метод осадження білків. Можна вважати, що пощастило, якщо при цьому виходить ще й суттєва очистка (при Висолювання з клітинного екстракту можна розраховувати на приблизно 2-10 кратне збагачення).

Чому саме сульфат амонію?

При рівній молярної концентрації полівалентні аніони долее ефективні для висолювання, ніж моновалентні (почасти через те, що має значення не концентрація солі, а іонна сила розчину), а полівалентні катіони навіть перешкоджають дії полівалентних аніонів. Виходить, що оптимально поєднання - це полівалентний аніон з моновалентною катіонами.

Ефективність висолювання убуває в серії Гофмейстера (Hofmeister):

Цитрат> Сульфат> Фосфат> Хлорид> Нітрат> тіоціонат

У цьому ж ряду убуває стабілізуючий ефект і зростають хаотропние властивості солі. Таким чином, найбільш відповідні кандидати: цитрат і сульфат. Сульфат більш зручний через кращої розчинності (наприклад, при нормальній температурі розчинність амонійних солей цитрату і сульфату рівні приблизно 2.5м і 4.1м); низької ціни і стабілізуючого впливу, який він чинить на більшість білків при концентраціях вище 0.5м.

(NH4) 2SO4 преципітують білки за двома механізмам

сульфат-іони роблять молекулу білка більш компактною (менше розчинної) за рахунок взаємодії з позитивно зарядженими амінокислотами. Ця взаємодія більш еффеектівно при pHзневоднення. Один іон SO42 - має 13-14 молекул H2O тільки в першому гідратний шарі і, можливо, більше - у другому. Якщо одна молекула сульфату координує навіть 15 молекул H2O, то 3M сульфат амонію пов'язує 45 з наявних у воді 55M молекул H2O.

Іонна сила розчину

I = 1 / 2ci (zi) 2,

де:

ci - концентрація іона; zi - заряд іона.

Наприклад, для 1M NaCl: I = 1/2 (1 (1) 2 + 1 (1) 2) = 1 для 1M (NH4) 2SO4: I = 1/2 (2 (1) 2 + 1 (1) 2 ) = 3

Розчинність білків

Вплив іонної сили і температури При низькій іонній силі (<0.2M) розчинність білка збільшується при підвищенні концентрації солі, так як екранування тяжіння протилежно заряджених груп призводить до розпушення структури білка. При високій іонній силі (> 0.2M) - розчинність білка знижується із за висолювання і зневоднення. Вона падає експоненціально з підвищенням іонної сили: logS = ? - KsI, де:

S [g / l] - розчинність білка; I - іонна сила; ?; Ks - константи.

Ks - злегка розрізняється для різних білків і майже не залежить від pH і температури. ? - сильно залежить від білка, pH і температури; підвищення температури викликає зниження ? => зменшення розчинності білка.

Вплив pH. При низькій іонній силі (<0.2M) розчинність білка мінімальна при pH рівному ізоелектричної точці білка. При високих концентраціях (NH4) 2SO4 розчинність підвищується з підвищенням pH, так як при низьких pH сульфат іон Компактізующее білок взаємодіючи з позитивно зарядженими групами. Так що краще проводити осадження при pHВплив початкової концентрації білка Білки бувають двох типів. Для типу I розчинність не залежить від вихідної концентрації білка; для типу II - залежить сильно.

Обмеження методу.

Висока концентрація іонів амонію в осаді може заважати точному визначенню концентрації білка.

Висаліваются не тільки білки, а й, наприклад, детергенти. Наприклад, 0.5% Tween 20 і Triton X100 починають агрегувати при концентраціях сульфату амонію більше 1M. Утворений преципитат має щільність трохи менше щільності сольового розчину. При центрифугировании він спливає, прихоплюючи з собою білки.

Осадження сульфатом амонію не можна використовувати для білків, що вимагають присутності Ca2 + через нерастворимости сульфату кальція.Лекція 4. Буферні розчини та спеціальні добавки. Ультрафільтрація. Діаліз. Детергенти та їх застосування

Буферні розчини (синонім: буферні суміші, буферні системи, буфери) - розчини з певною концентрацією водневих іонів, що містять сполучену кислотно-основну пару, що забезпечує стійкість величини їх водневого показника при незначних змінах концентрації або при додаванні невеликої кількості кислоти або лугу.

Кислотно-основна пара Б. р. являє собою слабку кислоту та її сіль, утворену сильною основою (наприклад, оцтова кислота СН3СООН і ацетат натрію CH3COONa) або слабка основа і його сіль, утворену сильною кислотою (наприклад, гідроокис амонію NH4OH і хлористий амоній NH4CI). При розведенні розчину або додаванні до нього деякої кількості кислоти або лугу кислотно-основна пара здатна відповідно бути донором або акцептором водневих іонів, підтримуючи Т.ч. величину водневого показника на відносно постійному рівні.

Буферні розчини зберігають стійкість буферних властивостей у певному інтервалі значень рН, тобто володіють певною буферною ємністю. За одиницю буферної ємності умовно приймають ємність такого буферного розчину, для зміни рН якого на одиницю потрібно додати 1 моль сильної кислоти або сильної луги на 1 л розчину. Буферна ємність знаходиться в прямій залежності від концентрації Б. р .: ніж концентрированнее розчин, тим більше його буферна ємність; розведення Б. р. сильно зменшує буферну ємність і лише незначно змінює рН.

Тканинна рідина, кров, сеча та інші біологічні рідини є буферними розчинами. Завдяки дії їхніх буферних систем підтримується відносна сталість водневого показника внутрішнього середовища, що забезпечує повноцінність метаболічних процесів. Найбільш важливою буферною системою є бикарбонатная система крові. Концентрація в крові бікарбонатів служить одним з основних показників кислотно-лужного стану організму. Цей показник дозволяє встановити характер порушення кислотно-лужної рівноваги при ряді патологічних процесів.

У лабораторній практиці Б. р. використовують в тих випадках, коли те чи інше дослідження може бути проведене лише при постійному значенні рН (наприклад, визначення активності ферментів, вивчення кінетики ферментативних реакцій, електрофоретичної поділ білкових сумішей і ін.) і в якості стандартів при визначенні рН різних розчинів, в т . ч. біологічних рідин.

Буферні розчини готують зазвичай шляхом розчинення у воді взятих у відповідних пропорціях слабкої кислоти та її солі, утвореної лужним металом, часткової нейтралізації слабкої кислоти сильним лугом або слабкої основи сильною кислотою, розчинення суміші солей багатоосновної кіслоти.Лекція 5. Загальні принципи хроматографії, класифікація хроматографічних методів

Всім хроматографическим методам притаманні деякі загальні характеристики, що дозволяють нижче викласти елементи їх узагальненої теорії. Однак спочатку розглянемо специфічні особливості різних варіантів хроматографічного фракціонування. Це, з одного боку, дозволить за теоретичними міркуваннями весь час бачити реальні риси хроматографічного експерименту, а з іншого - дасть можливість ввести класифікацію хроматографіче-ських методів. У ході подальшого викладу (зокрема, для його розбиття по главах) найзручніше класифікувати методи за основним принципом фракціонування. Таку класифікацію ми розглянемо досить докладно і лише наприкінці розділу коротко відзначимо інші можливі варіанти класифікації.

КЛАСИФІКАЦІЯ ЗА ПРИНЦИПОМ фракціонування.

Як уже згадувалося, в будь-якому хроматографическом процесі фігурують нерухома і рухома фази, між якими розподіляються молекули фракціоніруемой суміші речовин. Під основним принципом фракціонування будемо розуміти природу фізичного, хімічного або біологічного явища, що обумовлює такий розподіл.

Класифікація за способом елюції.

Фронтальний аналіз.

Так називається варіант хроматографічного процесу, коли розчин суміші компонентів безперервно подається на вхід хроматографічної колонки. На виході її в цьому випадку з'являються один за іншим кілька "фронтів" елюата. За першим з них слід чистий, швидше за інших мігруючий в даній системі компонент суміші, що відрізняється, очевидно, найменшим спорідненістю до нерухомій фазі. Другий фронт відзначає додавання до нього наступного за рухливості компонента. За третім фронтом слід вже суміш трьох компонентів. В даний час з цілком зрозумілих причин фронтальний аналіз майже вийшов з ужитку і застосовується лише в окремих, спеціальних випадках.

Витіснювальний хроматографія.

У цьому варіанті в колонку або на стартову лінію хроматографічної пластинки наносять певну порцію розчину вихідної суміші речовин, а потім ведуть елюції розчином речовини, що володіє свідомо більшою спорідненістю до нерухомій фазі хроматографічної системи, ніж будь-який з компонентів суміші. Відбувається витіснення їх з нерухомої фази, причому в першу чергу тих, які володіють меншою спорідненістю до сорбенту, а потім і всіх інших. Елюент виштовхує всі компоненти суміші попереду себе на зразок поршня. Так як вони виходять в рухому фазу концентрованими, то між ними також йде конкуренція за зв'язок з нерухомою фазою. Компоненти, поступаються іншим в силі спорідненості до цієї фазі, відтісняються ще вперед, де сорбируются, але тільки до тих пір, поки їх знову не витіснять компоненти, що володіють більшою спорідненістю до сорбенту. В результаті такого чергування сорбції та витіснення компоненти суміші будуть виходити з колонки один за іншим в порядку зростання сили їх зв'язку з нерухомою фазою. Ясно, що при цьому зони сусідніх компонентів будуть стикатися або навіть трохи перекриватися один з одним. Для аналітичного фракціонування метод непридатний, але вдалий для препаративного або напівпромислового розділення речовин, оскільки ємність колонки тут використовується дуже ефективно.

Хроматографічна елюція.

На відміну від попереднього в цьому методі елюіруют розчин володіє меншим спорідненістю до сорбенту, ніж будь-який з компонентів вноситься на колонку або пластинку суміші речовин. Ці компоненти поступово "вимиваються" з нерухомої фази і рухаються вздовж колонки за рахунок безперервного перерозподілу їх молекул між нерухомою фазою і елюентом. Кожен з них мігрує незалежно від інших відповідно до співвідношення сил його спорідненості до нерухомої і рухомої фаз. Міграція йде тим повільніше, чим більше спорідненість до нерухомій фазі. Саме цей, придатний для аналітичних цілей варіант хроматографії докладно розглянуто в наступному розділі, тому тут можна обмежитися вказівкою на те, що при хроматографічної елюції компоненти суміші виходять з колонки окремими, розділеними одна від одної зонами, які відповідно до типовою формою профілю розподілу речовини в кожної такої зоні (див. нижче) часто називають хроматографічними піками.

КЛАСИФІКАЦІЯ по розташуванню нерухомої фази.

Ця класифікація не вимагає особливих пояснень. Якщо пористі гранули гелю або сорбенту для будь-якого типу хроматографії заповнюють скляну або металеву колонку, то говорять про хроматографії на колонці, або "колоночной хроматографії", хоча останній вираз відноситься до категорії вкоріненого жаргону. Хроматографію на колонці в багатьох випадках тепер ведуть при дуже великому тиску подачі елюента (до 300-400 атм), що дозволяє зменшити діаметр гранул до 5-10 мкм з витікаючими звідси (див. Нижче) істотними перевагами у швидкості і якості фракціонування микроколичеств вихідної речовини . За це доводиться розплачуватися використанням дорогих сталевих прецизійних колонок та спеціальної апаратури, але у випадку серійних аналізів такі витрати себе виправдовують. Рідинний хроматограф на колонках при високому тиску домовимося скорочено позначати ЖХВД. В англійській літературі прийнято позначення HPLC, яке розшифровують як "high pressure (іноді - Align performance) liquid chromatography".

Якщо хроматографический процес йде в похило розташованому, рівному і відносно товстому (кілька міліметрів), відкритому з поверхні шарі гранул, між якими рідина рухомої фази тече тільки під дією сили тяжіння, то його можна назвати хроматографією в товстому шарі "Практично цей метод знайшов собі застосування тільки для гель-фільтрації.

Тонкий (0,1-0,5 мм) шар гранул, адсорбованих або іншим чином закріплених на поверхні пластинки зі скла або пластику, дозволяє здійснювати хроматографії в тонкому шарі, або "тонкошарової хроматографії" (ТШХ). Англійське позначення TLC (thin layer chromatography). Рух рідкої фази відбувається за рахунок капілярних сил.

Замість тонкого шару сорбенту на основі целюлози можна використовувати просто фільтрувальний папір, іноді спеціальну - з введеними в неї йоногенних групами. Відповідний процес слід називати хроматографією на папері.

Замість паперу для аналогічного типу хроматографії використовують плівки з модифікованої целюлози, поліамідні плівки і т.д. - Це варіанти хроматографії на плівках,

Пластинки, папір або плівка можуть розташовуватися горизонтально або вертикально; в останньому випадку рух рухомої фази може бути висхідним або низхідним - це не грає принципової ролі, так як воно обумовлене в основному капілярними силами. Препарати на пластинки або папір найчастіше наносять у вигляді смужки або плями розчину у одного краю сорбенту, неподалік від рівня елюіруют рідини, в яку цей край занурюють. Останнім часом для ТШХ все частіше застосовують варіант кільцевої хроматографії, коли початковий препарат наносять у вигляді кільця, а елюція йде радіально.Лекція 6. Матеріали матриць сорбентів і обмінників. Техніка колоночной хроматографії

Матрицею називають тверду основу нерухомою хроматографічної фази. Вона має вигляд суцільних або пористих гранул; останні часто являють собою просторову сітку лінійних полімерів. Для додання матеріалу матриці необхідних для хроматографії властивостей його модифікують. Модифікація може представляти собою хімічну приєднання ("присадку") йоногенних груп, гідрофобних молекул, біологічно активних речовин або фіксацію шляхом адсорбції тонкого шару розчинника. Хоча особливості хроматографічного процесу визначаються в основному характером модифікації, фізико-хімічні параметри матриці можуть істотно впливати на властивості нерухомої фази. До таких параметрів відносяться наступні: розміри і форма гранул і їх пор; діапазон розкиду цих розмірів; механічна міцність матеріалу матриці; характер його змочування і набухання в елюенті; хімічна стійкість та інертність в умовах хроматографічної елюції; реакційна здатність, що забезпечує можливість хімічної модифікації матриці.

Одні й ті ж матриці, по-різному модифіковані, можуть утворювати нерухому фазу для різних хроматографічних методів, тому щоб уникнути повторень в даній главі ми познайомимося з фізико-хімічними властивостями всіх вживаних в даний час матриць, а їх модифікації (а також властивості і номенклатуру одержуваних шляхом цих модифікацій сорбентів) розглянемо у наступних розділах, присвячених різним методам хроматографії. Перш ніж перейти до аналізу властивостей різних матриць, вкажемо загальні для них способи позначення діапазону лінійних розмірів гранул (а для сфер - їх діаметрів). Цей діапазон вказують або безпосередньо в мікронах, або у вигляді інтервалу чисел "МЕШ" ("mesh"). Число МЕШ відповідає числу ниток на дюйм в сітці з квадратними осередками, через яку просіваються гранули. З урахуванням товщини самих ниток це означає, що через сітку в 100 МЕШ пройдуть всі гранули, максимальний розмір яких менше 160 мкм, через сітку в 200 МЕШ - менше 80, 400 МЕШ - менше 40. Таким чином, діапазон розмірів гранул 40-80 мкм відповідає 200-400 МЕШ. У нього потраплять гранули, які просіваються через сітку в 200 МЕШ, але не проходять через осередки сітки в 400 МЕШ. Для дрібних гранул, розмір яких менше 40 мкм, прийнято позначення - 400 МЕШ.

Хроматографическую колонку.

Колонки, виготовлені в лабораторії.

У лабораторній стеклодувной майстерні нескладно виготовити скляну колонку діаметром до 8 см і довжиною до 1,5 м. Зверху колонка забезпечена стандартним шліфом № 14 або. № 29, куди вставляється шліфована пробка з крапельницею. Остання забезпечена оливою малого діаметру, на яку можна надіти трубочку із силіконової гуми, куди вставляється тонка (1-2 мм) поліетиленова або тефлонова трубка від насоса. На нижній кінець крапельниці доцільно надегь з деяким перекосом шматочок поліетиленової трубочки так, щоб при установці пробки на місце трубочка майже стосувалася стінки колонки. Цим запобігається взмучіваніе верхнього шару сорбенту при падінні краплі. Верхню половину поверхні шліфа змащують силіконовим мастилом, але так, щоб мастило не потрапляла всередину колонки. У момент установки в гніздо пробку трохи провертають. Якщо шліф добре притерти, шар мастила повинен бути прозорим. Герметичність посадки пробки слід перевіряти перед кожним досвідом - при непрацюючому насосі рідина з колонки не повинна витікати. У більш простому варіанті шлифованную скляну пробку можна замінити на гумову.

У нижню частину колонки заплавляются скляний фільтр. Щоб не забиватися, його пори повинні бути свідомо меншого розміру, ніж гранули сорбенту. Разом з тим небажано, щоб фільтр являв собою великий опір току елюента. Для сорбентів, що використовуються при звичайній хроматографії низького тиску, з гранулами НЕ дрібніше 30 мкм в поперечнику підходить скляний фільтр № 3. Однак він може поступово забиватися, якщо використовується сорбент, засмічений "пилом", що утворюється при його стиранні. Щоб уникнути цього не слід нехтувати описаної нижче операцією "відмулювання" сорбенту. Слід також пам'ятати про те, що скляний фільтр сорбує деяку кількість білка або нуклеїнової кислоти. З цієї точки зору в якості фільтрів слід віддати перевагу поліамідні (найлон) або тефлонові пористі пластинки. Однак колонку в цьому випадку доведеться робити збірної, що значно ускладнює її конструкцію. Такі фільтри використовуються в продажних фірмових колонках.

Під фільтром, при переході до зливної трубці малого діаметра утворюється конічна порожнину. При виготовленні колонки треба прагнути до того, щоб обсяг цієї порожнини був мінімальним, оскільки в ній може відбуватися змішування близько йдуть фракцій. На зливний трубці є така ж, як на пробці, олива для трубочки із силіконової гуми, куди вставляється тонка трубка, що йде до денситометрів. Гумову трубочку зручно пережимати гвинтовим затискачем, "замикаючи" таким чином вихід з колонкі.Лекція 7. Адсорбційна і розподільна хроматографії

У адсорбційної хроматографії поділ речовин, що входять в суміш і рухаються по колонці в потоці розчинника, відбувається за рахунок їх різної здатності адсорбуватися і десорбувати на поверхні адсорбенту з розвиненою поверхнею, наприклад, силікагелю.

У розподільній ВЕРХ поділ відбувається за рахунок різної розчинності поділюваних речовин в нерухомій фазі, як правило, хімічно прищепленої до поверхні нерухомого носія, і рухомий фазі - розчиннику. Цей метод розділення найбільш популярний, особливо у випадку, коли прищеплена фаза являє собою неполярний алкільний залишок від C8 до C18, а рухома фаза більш полярна, наприклад суміш метанолу або ацетонітрилу з водою. Це так звана звернених-фазна (обернено-фазна, або зі зверненням фаз) хроматографія.Лекція 8. Тонкошарова хроматографія

Тонкошарова хроматографія (ТШХ) спочатку була розроблена для розділення ліпідів. Хоча хроматографія на папері швидше, ніж хроматографія на колонці, до недоліків її слід віднести те, що папір може бути виготовлена ??тільки з матеріалів на основі целюлози, що не дозволяє застосовувати її для поділу неполярних речовин. Тонкошарова хроматографія зберігає всі переваги хроматографії на папері, але при цьому дозволяє використовувати будь-який матеріал, який можна тонко подрібнити і отримати потім однорідний шар. Це можуть бути неорганічні речовини, наприклад силікагель, оксид алюмінію, діатомова земля і силікат магнію, а також органічні речовини, зокрема целюлоза, поліаміди та порошок поліетилену.

Платівку з закріпленим сорбентом поміщають в камеру, яка містить розчинник, і виявляють висхідній хроматографією. Після того як фронт розчинника майже досягне верхнього краю, пластинку виймають з камери і сушать. Для отримання двовимірної хроматограми висушену платівку можна повторно хроматографіровать під прямим кутом у іншому розчиннику. Положення плям, як і при хроматографії на папері, визначають за забарвленням, по флуоресценції або при обприскуванні різними реагентами, які реагують з речовинами в плямі з утворенням забарвлених продуктів. Зазвичай використовують наступні реагенти: нингидрин для амінокислот, родамін В для ліпідів, хлорид сурми для стероїдів і терпенів, сірчану кислоту з наступним нагріванням практично для всіх органічних сполук (відбувається обвуглювання), перманганат калію в сірчаної кислоти для вуглеводнів, анісовий альдегід в сірчаної кислоти для вуглеводів, пари брому для олефінів і т.д. Речовини можна елюіровать шляхом соскребанія.Лекція 9. Ионообменная хроматографія

Іонообмінної хроматографії, рідинна хроматографія, заснована на разл. здатності поділюваних іонів до іонного обміну з фиксир. іонами сорбенту, що утворюються в результаті дисоціації іоногенних груп останнього. Для поділу катіонів використовують катіоніти, для поділу аніонів - аніоніти (див. Іоніти). Елюентом в першому випадку служить р-р кислоти, у другому - р-р лугу. Поділ іонів регулюють підбором оптим. значень рН елюенту. Сильнокислотний сульфокатіоніти і високоосновні аніоніти можуть використовуватися при будь-яких значеннях рН, слабокислотні карбоксильні катіоніти - тільки при рН> 6; слабоосновние аніоніти знаходяться в ионизованном стані при рН <8. Варіюючи рН елюенту, можна різко змінювати ступінь іонізації компонентів суміші, (сорбат) і, отже, час їх утримування, домагаючись необхідної селективності розділення. Багатозарядні іони утримуються іонітом сильніше однозарядних. При рівних величинах зарядів утримування падає з ростом радіуса гидратирующие. іона. Тому при І. х. в разб. р-рах на сульфокатіонітах час утримування катіонів падає в ряду: Ва2 +> РЬ2 +> Sr2 +> Са2 +> Ni2 +> Cd2 +> Сu2 +> Со2 +> Zn2 +> Mg2 +> UO2 +> Тl +> Ag +> Cs +> Rb +> K +> NH4 +> Na +> H +> Li +. Для орг. іонів на електростатіч. взаємодій. з фиксир. зарядами ионита накладається ще й гидрофобное взаємодій. орг. частини іона з матрицею ионита. Щоб зменшити його внесок у утримування орг. іонів і домогтися оптим. селективності їх поділу, до водного елюентом додають орг. компонент (1-25% метанолу, изопропанола, ацетонітрилу або діоксану). Елюент в І. х. крім к-ти чи підстави і орг. добавок може містити нейтральний електроліт, напр. NaNO3, іони к-якого конкурують з розділяються іонами за взаємодій. з сорбентом; при цьому утримування однозарядних іонів падає пропорційно концентрації солі в розчині, двозарядних іонів - пропорційно її квадрату. неорг. х. взаємодій. Хроматофокусірованіе

Хроматофокусірованіе - метод іонообмінної хроматографії, що використовує в якості інструменту поділу градієнт рН, що формується в шарі сорбенту всередині колонки. Метод успішно застосовують для розділення цвіттер-іонних біологічних макромолекул [1-3]. Формування внутрішнього градієнта рН в хроматофокусірованіі полягає в попередньому зрівноважуванні аніонообмінної хроматографічної колонки стартовим розчином (СР) з високим значенням рН, що містить слабка основа, і в подальшому пропущенні елюента з більш низьким рН, складеного з слабких органічних кислот або амфолітов.

Запропоновано варіант хроматофокусірованія перехідних металів, що поєднує принципи комплексообразовательной хроматографії з формуванням спадного градієнта рН всередині колонки, заповненої сорбентом з прищепленими олігоетіленамінамі.

В основі цього варіанту лежить утворення амінних комплексів іонів металів (наприклад, Cu2 +, Co2 +, Ni2 +, Zn2 +, Cd2 +, Fe3 +, Cr3 +, Mn2 +, UO22 +, Pb2 +) при початковому значенні рН 7,0 - 7,5 і їх подальша дисоціація при лінійному зниженні рН до 3. Можливості методу продемонстровані на прикладі концентрування і розділення 4 - 5 іонів металів з вивченого ряду у варіантах хроматографії низького тиску і ВЕРХ [4, 5]. На даний момент ведуться роботи на карбоксильних катіонообменних сорбентах.

Це пов'язано з тим, що комплексообразование іонів металів з олігоетіленамінамі є багатоступеневим процесом з повільною кінетикою. У випадку з карбоксильними сорбентами, ймовірно, вдасться розширити коло іонів металів, поділюваних в умовах формування низхідного градієнта рН, включивши в нього лужноземельні метали. Відзначимо, що спадні градієнти рН всередині катіонообменних колонок в хроматофокусірованіі що раніше не получалі.Лекція 11. Афінна хроматографія

Афінної хроматографії (від лат. Affinis - споріднений) (біоспеціфіч. Хроматографія, хроматографія по спорідненості), метод очищення і розділення білків, заснований на їх избират. взаємодій. з лігандом, ковалентно зв'язаним з інертним носієм. У кач-ве лігандів використовують соед., Взаємодій. яких брало з розділяються в-вами засноване на біол. ф-ції останніх. Так, при поділі ферментів (для чого переважно. І застосовується А. х) лигандами служать їх субстрати, інгібітори або коферменти. Головна особливість, до-раю обумовлює високу ефективність А. х., Полягає в тому, що поділ грунтується на відмінності не фіз. - Хім. ознак молекули (заряду, форми і розміру), а специфічний. функціональних св-в, що відрізняють даний фермент від безлічі ін. біополімерів.

Нерухома фаза в А. х. являє собою спеціально отримується сорбент, побудований зазвичай за схемою: носій - з'єднує ланка ("ніжка") - специфічний. лиганд. Носієм служить найчастіше сефарозапроізводное агарози, що має поперечні зшивки. Приєднання до неї лиганда або "ніжки", що містять, як правило, аміногрупу, здійснюється після активації сефарози бромцианом:

Зміст лиганда коливається від 0,1 до 10 мкмоль на 1 г вологого сорбенту. Сефароза, однак, малоустойчива до дії ряду хім. в-в і мікроорганізмів.

Більш стабільні макропористі неорг. носії (кремнезем, скло) і орг. полімери. Якщо ліганд приєднується безпосередньо до носія, ефективність специфічний. взаємодій. з ферментом помітно знижується внаслідок просторів. утруднень. "Ніжка", як правило, усуває стеріч. перешкоди, віддаляючи лиганд від носія. Як і носій, вона повинна бути інертною і не впливати на процеси в ході А. х., Чого, однак, не завжди вдається досягти. Напр., Приєднання "ніжки" за наведеною вище р-ції призводить до утворення катіонної угруповання ізомочевіни, і сорбент набуває св-ва аніоніта. У кач-ве "ніжки" використовують зазвичай ді - і поліаміни, амінокислоти, пептиди, олігосахариди.

Лигандами можуть служити субстрати (напр., Крохмаль або глікоген при поділі амілаз), проте їх превращ. в ході А. х., що каталізує розділяються ферментом, постійно змінює св-ва сорбенту. Тому, як правило, застосовують аналоги субстратів, стійкі до подальшого превращ., Тобто інгібітори ферментів. Так, для виділення протеїназ використовують не розщеплюються ними пептиди D-амінокислот. Ефективні прир. інгібітори ферментів, напр. пепстатін - інгібітор аспартільних протеїназ. Іноді застосовують ліганди, що зв'язують великі групи споріднених ферментів (зокрема, кінази і дегідрогенази). Приклади таких "группоспеціфіч." лігандів-антрахінонові барвники, аналоги нікотінамідаденіндіну-клеотіда.

Відомі ліганди (напр., Похідні фенілборной к-ти), що імітують при взаємодій. з ферментом структуру перехідного комплексу з субстратом. Такі ліганди ефективні при виділенні серинових гідролаз.

Поділ в А. х. зазвичай проводять на хроматографіч. колонках; іноді розділяється суміш поміщають в посудину з сорбентом і витримують до повного зв'язування досліджуваного компонента. Потім сорбент (в колонці або посудині) промивають буферним розчином для видалення незв'язаних в-в, після чого десорбируют досліджуваний компонент.д.есорбція (елюція) останнього зазвичай досягається підвищенням іонної сили, зміною рН буферного розчину або додаванням у нього орг . р-розчинника, що послаблює взаємодій. лиганд - фермент. Більш вибіркова десорбція р-ром лиганда.

Крім ферментів, методом А. х. можна виділяти також токсини, рецептори, інгібітори, транспортні білки та ін. біологічно активні в-ва. Високою вибірковістю відрізняється т. Зв. іммуносорбція, при до-рій в кач-ве лиганда використовують антитіла, що володіють специфічністю до виділеним білкам; особливо ефективні моноклональні антитіла.

Для розділення білків застосовується також ряд ін. Аналогічних методов.Т. наз. ковалентная хроматографія заснована на избират. освіті і подальшому розщепленні ковалентних зв'язків між які виділяються в-вом і носієм, напр. між білком з SH-групами і ртуть-орг. похідними агарози.

Застосовується також лігандообменная хроматографія, при до-рій ферменти зв'язуються через функціональний іон металу з комплексоном, іммобілізованим на носії.

Набула поширення гидрофобная хроматографія, при до-рій сорбент (напр., Фенілсефароза), що містить гідрофобні угруповання, вкраплені в гідрофільну матрицю, взаємодіє з гідрофобними ділянками, що містяться на пов-сті білків. Нерідко при цьому спостерігаються також іонообмінні взаємодій., Як, напр., При використанні в якості сорбенту алкіламіносефароз. Избират. виділення гликопротеинов забезпечують імобілізовані на носіях лектини - білки, специфічно взаємодіють з кінцевими моносахаридними ланками вуглеводних ланцюгів.

Іммобілізовані субодиниці ряду білків з четвертичной структурою м. Б. використані для вилучення цих білків із складних сумішей внаслідок специфічний. межсуб'едінічних контактів. А. х. сформувалася як метод в кон.60-х гг.20 в.Лекція 12. Гель-фільтрація

ГЕЛЬ-ФІЛЬТРАЦІЯ ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА МЕТОДУ.

Звична назва "гель-фільтрація" для хроматографічного методу фракціонування молекул за їх розмірами можна зберегти і в разі хроматографії при високому тиску, де серед використовуваних жорстких пористих матриць головну роль грає силікагель. Іноді використовують і такі назви, як "молекулярно-ситова" ("molecular sieve") або "ексклюзивна" ("exclusion ...") хроматографія.

Нерухома фаза при гель-фільтрації представлена ??рідиною, що знаходиться всередині пористих, добре змочуваних гранул, що заповнюють хроматографическую колонку. Якщо на таку колонку подається розчинена в елюенті суміш молекул різних розмірів, то великі молекули, нездатні проникнути всередину гранул, будуть рухатися уздовж колонки разом з рухомою фазою;

для них коефіцієнт розподілу До == 0. У той же час найбільш дрібні молекули, розміри яких свідомо менше діаметра пір в гранулах, будуть рівномірно розподілятися між рухомою і нерухомою фазами. Для них буде здійснюватися хроматографический процес з властивим йому уповільненням міграції хроматографічної зони; значення К при цьому близько до одиниці. Для молекул проміжної величини завдяки статистичному розподілу розмірів пор виявиться доступною тільки частину обсягу нерухомої фази. Для них 0 <К <1, тому зона або зони таких молекул будуть мігрувати уздовж колонки швидше, ніж дрібні молекули, але повільніше, ніж великі. У результаті відбудеться фракціонування вихідної суміші молекул на зони залежно від їх розмірів. Зони виходять з колонки в порядку убування цих розмірів. У найпростішому випадку, коли у вихідній суміші містяться молекули тільки двох категорій (великі і дрібні), гель-фільтрація дозволяє здійснити "сортування" цих молекул ("group separation"). Зокрема, таким чином проводять знесолення розчинів біополімерів і очистку макромолекул від супутніх їм низькомолекулярних компонентів, наприклад від "попередників", що беруть участь в їх біосинтезі. Суміш молекул декількох проміжних розмірів в ході гель-фільтрації розділяється на ряд дискретних груп, що розрізняються між собою за ступенем доступності для них обсягу всередині гранул. Відповідні хроматографічні зони мігрують з різними швидкостями і виходять з колонки у вигляді розділилися "піків" Лекція 13. Теоретичні та методичні засади електрофорезу

ЕЛЕКТРОМІГРАЦІОННИЕ МЕТОДИ, методи дослідження в р-рах іонізують. в-в і поділу їх складних сумішей; засновані на явищі переносу заряджених частинок в електричні. полі, прикладеному до досліджуваного р-ру. Осн. параметр, що характеризує перенесення частинок, - рухливість і, тобто відстань l, нак-рої в-во переміститься під дією одиниці градієнта електричні. потенціалу Е за одиницю часу

Процеси, пов'язані з комплексоутворення, асоціацією або пересольватаціей іонів, а також зі зміною стану р-розчинника, призводять до зміни заряду або радіусу іонів, що впливає на їх рухливість; на цьому грунтується застосування Е. м. для дослідження р-ций в р-рах.

Неоднакова рухливість мовляв. іонів і заряджених частинок разл. хім. природи дозволяє використовувати Е. м. також для розділення сумішей; в даному випадку ці методи часто наз. електрофорезом.

Методи вимірювання рухливості заряджених частинок. Рухливість, або швидкість міграції індивідуальних іонів, можна визначати:

1) по зміні концентрації іонів досліджуваного елемента в приелектродному просторі при електролізі;

2) шляхом зміщення в електричні. поле вузьких зон досліджуваних іонів;

3) за допомогою рухомої межі між зонами (фронтальні методи, ізотахофорез).

Дослідження реакцій в розчинах. Інформацію про рівноважних процесах в розчині отримують при вивченні залежності швидкості міграції іонів досліджуваного елемента від концентрації одного або дек. беруть участь у р-ції в-в. З цієї залежності можна виявляти склад продуктів р-ції і визначати константи рівноваги.

У разі р-ций комплексообразования досліджуваний метал М може перебувати одночасно в дек. іонних формах зв'язку з лігандом А, між якими встановлюється рухлива рівновага. У такій системі загальне, або сумарне, переміщення в електричні. поле всіх іонів, що містять М і мають індивідуальні рухливості Иi, відбувається з нек-рій СР швидкістю ис, що характеризує сумарний електроміграціі. перенесення металу в одиницю часу:

де i - число лігандів в комплексі; - частка металу, пов'язаного в i-ую іонну форму; - повна константа стійкості іонної форми; [М], [А] і [МАi] - соотв. рівноважні концентрації металу, лиганда і комплексу.

Крива електроміграціі (рис.1), що відображає зміщення рухомого рівноваги між разл. іонними формами при зміні рівноважної концентрації ліганду, встановлює області існування: своб. іонів (I); координаційно ненасичених форм (II); координаційно насичених комплексних іонів (III).

Склад комплексних іонів можна визначати дек. прийомами: за емпі-річ. залежності між рухливістю іонів і величиною їх заряду; зі співвідношення загальної і рівноважної концентрацій ліганду, доорої визначається за швидкістю електроміграціі введеного в систему допоміжні. металу (по ур-нію 2); за співвідношенням між коеф. дифузії і рухливістю при одній і тій же концентрації ліганду. Константи стійкості іонних форм розраховують шляхом вирішення системи з п ур-ний виду (2), де п дорівнює числу іонних форм.

Рис.1. Залежність середньої швидкості міграції металу ісот концентрації ліганду [А]: I, II, Ш - галузі здійснення соотв. своб. іонів металу, координаційно ненасичених форм і координаційно насичених комплексних іонів.

При дослідженні хім. взаємодій в розчині важливе збереження сталості складу фонового електроліту, до-рої може порушуватися внаслідок електродних р-ций. Тому доцільно використовувати апаратуру, що запобігає проникнення продуктів електролізу в робочу частину приладу. Якщо ця умова виконана, то Е. м. Дають досить правильні результати завдяки тому, що відсутня необхідність введення в досліджувану систему нових фаз - іонообмінних смол, екстрагентів і т.п., що викликають побічні рівноважні процеси.

Крім рівноваг Е. м. Дозволяють досліджувати кінетику комплексоутворення, використовуючи явище доповнить. квазідіффузіонного розмивання під дією електричні. поля спочатку вузької зони, що містить разл. іонні форми з різними знаками заряду. Для досягнення цього ефекту необхідно докласти поле такої напруженості, щоб швидкість електроміграціі. переносу іонів перевищувала швидкість протікання комплексообразования.

Для вивчення кінетики р-ций можна використовувати також зонний електроміграціі іонів в нерівноважному з ними електроліті. В обох випадках застосування Е. м. Доцільно при аналізі процесів, швидкість яких брало лежить у прикордонній області між повільними і швидкими р-ціями.

Закономірності електроміграціі іонів в розплавах солей досліджені в значно меншому ступені, ніж у водних розчинах. Звичайна середу при проведенні електроміграціі в розплавлених солях - безводні розплави нітратів і перхлоратов лужних металів або евтектіч. суміші, що мають порівняно низьку т-ру плавлення.

Для електроміграціі в розплавах характерні дві осн. проблеми: сильне взаємодій. іонів досліджуваних металів і розплавленої солі; відсутність електрично нейтрального р-розчинника, для к-якого можна виміряти справжню швидкість руху іонів. Тому зазвичай їх рухливість визначають щодо приладу, в к-ром проводять електроміграціі. У цьому випадку дані про рухливості в розплавах зміщені на невідому постійну велічіну.Лекція 14. ізоелектричного фокусування і ізотахофорез

Фокусирующий іонний обмін. Цей метод часто наз. електрофоретіч. фокусуванням або просто електрофокусірованіем, пов'язаний з накладенням градієнта концентрації або рН розчину паралельно електричні. полю. Завдяки цьому розділяються іони можуть змінювати величину і знак заряду в міру переміщення в поле градієнта. При цьому в фиксир. точках системи кожен компонент переходить в ізоелектрічен. стан, в к-ром пор. заряд частинок даного компонента дорівнює нулю. Згадані точки є місцем концентрування (фокусування) окремих компонентів суміші (рис.5). Положення зон фокусування визначається градієнтом концентрації комплексоутворюючою реагенту або рН розчину і константами стійкості комплексних іонів поділюваних елементів. При поділі суміші білків або ін. Амфотерних соед. становище зон визначається значеннями їх ізоелектрічен. точок.

Для створення градієнта рН електродні камери заповнюються буферними розчинами з різними значеннями рН. Напр., Для поділу рідкоземельних елементів церієвої групи в 0,001 М розчині етилендиамінтетраоцетової к-ти рН повинен змінюватися по довжині колонки від 1,7 у анода до 2,4 у катода.

У сер.60-х гг.20 в. було запропоновано створювати градієнт рН за допомогою амфолітов - сумішей аліфатіч. поліамінокислот. Під впливом електричні. поля амфоліти розподіляються відповідно до своїх ізоелекгріч. точками і тим самим утворюють градієнт рН. Застосування амфолітов дозволяє добитися вельми високої роздільної здатності методу: в деяких випадках вдається розділити білки, ізоелектрічен. точки яких брало розрізняються на 0,02 одиниці рН.

Схема, що пояснює метод електрофокусірованія: а - утворення градієнта концентрації ліганду [А]; б - розподіл іонних форм мігранта; в - концентрування лиганда у вузькій зоні; см-концентрація мігранта.

Описаний метод, будучи самостійним, в той же час являє собою варіант зонного електрофорезу. У всіх модифікаціях останнього ідентифікацію і кількостей. визначення в-в в зонах можна проводити як безпосередньо на носії, так і після елюювання. В обох випадках використовують методи радіоактивних індикаторів, фотометрію в прямому і відбитому світлі, люмінесцентний аналіз.

Фронтальні методи засновані на вимірі швидкості переміщення кордону розділу розчинів з різною щільністю. Класичні. варіант методу був розроблений в 1930 і з тих пір застосовується для визначення рухливості і поділу високомол. в-в, зокрема білків. У простій модифікації методу в U-подібну трубку поміщають р-р білків, а над ним буферний електроліт, в к-рий занурені електроди. При накладенні електричні. поля індивідуальні білки переміщаються з разл. швидкостями, утворюючи серію кордонів. Їхнє становище реєструють оптич. методами по зміні коеф. заломлення.

Ізотахофорез. Осн. частиною приладу служить капілярна трубка з анодним і катодним резервуарами на кінцях. При аналізі аніонів анодное відділення і капіляр заповнюють т. Зв. лідируючим електролітом, що містить аніон з високою рухливістю. СР швидкість міграції аніонів в цьому електроліті повинна бути вище рухливості будь-якого аніону в досліджуваній суміші. Катодне відділення заповнюють т. Зв. замикаючим електролітом, аніон догрого має рухливість меншу, ніж рухливість будь-якого ін. аніону в суміші. Аналізований зразок, в к-ром потрібно визначити зміст аніонів, вносять між попереднім і замикаючим електролітами. Після подачі напруги (5-10 кВ) при силі струму до 100 мкА в міру руху аніонів до катода поступово утворюються зони індивідуальних аніонів певної довжини, розділені чіткими межами, ширина яких брало становить 0,2-0,3 мм при діаметрі капіляра 0 , 1 мм. Після цього всі зони будуть переміщатися з однаковою швидкістю (звідси назв. Методу). Співвідношення концентрацій аніонів у двох сусідніх зонах с1і С2в сталому режимі буде визначатися виразом Кольрауша:

с1 / с2 = n1 / n2, (4)

де n1і n2- числа переносу.

При аналізі катіонів лідируючий електроліт повинен містити катіони з високою рухливістю, що замикає - з мінім. для даної системи швидкістю міграції.

Кількість в-ва в зоні Q і її довжина l в капілярі постійного перетину S пов'язані простим співвідношенням:

Q = ClS, (5)

де С - коеф. пропорційності.

У установівшеся режимі градієнт потенціалу при переході від лідируючого до замикаючому електролітів стрибкоподібно зростає відповідно до рухливістю іонів, що складають дану зону. Це призводить до температурних стрибків між зонами, реєструючи к-які за допомогою термопари можна визначити відстань між зонами і за виразом (5) знайти кол-во в-ва в зоне.Лекція 15. Виявлення, кількісне визначення і характеристика макромолекул після електрофорезу

На електрофоретичної розділення антигени наносять імунні сироватки, що містять різні специфічні антитіла. При зустрічі відповідних антигену і антитіла в зоні оптимального їх співвідношення спостерігається реакція преципітації неозброєним оком. Імунний електрофорез поєднує переваги електрофорезу та імунної реакції: висока роздільна здатність методу, що розділяє компоненти аналізованої системи на основі електрофоретичної мобільності та висока специфічність імунних антісивороток.Лекція 16. Принцип імунного електрофорезу. Іммунофіксація

Електрофорез з іммунофіксаціей (JFE) - це двоступінчастий процес, що використовує електрофорез протеїнів на першому етапі і іммунопреціпітаціі на другому. При цьому дослідженню може бути піддана сироватка крові, сеча, спинномозкова або інша рідина організму. Електрофорез з іммунофіксаціей - один з найсучасніших методів в кинической лабораторії для отримання характеристик моноклональних імуноглобулінів. Моноклональна гаммопатія характеризується неконтрольованою проліфірацію одного клону плазмових клітин за рахунок інших клітин. Ця дисфункція часто призводить до синтезу великої кількості одного імуноглобуліну або його субодиниці зі зниженням нормальних рівнів імуноглобулінів. При цьому на електрофореграмме виявляється один різко збільшений пік в бета-гамма-області.Лекція 17. Електросінерез. Електроіммуноаналіз

Перехресний іммуноелектрофорез.

Інформацію про рівноважних процесах в розчині отримують при вивченні залежності швидкості міграції іонів досліджуваного елемента від концентрації одного або дек. беруть участь у р-ції в-в. З цієї залежності можна виявляти склад продуктів р-ції і визначати константи рівноваги. У разі р-ций комплексообразования досліджуваний метал М може перебувати одночасно в дек. іонних формах зв'язку з лігандом А, між якими встановлюється рухлива рівновага. У такій системі загальне, або сумарне, переміщення в електричні. поле всіх іонів, що містять М і мають індивідуальні рухливості Иi, відбувається з нек-рій СР швидкістю ис, що характеризує сумарний електроміграціі. перенесення металу в одиницю часу:

де i - число лігандів в комплексі;

- Частка металу, пов'язаного в i-ую іонну форму;

- Повна константа стійкості іонної форми; [М], [А] і [МАi] - соотв. рівноважні концентрації металу, лиганда і комплексу.

Крива електроміграціі (рис.1), що відображає зміщення рухомого рівноваги між разл. іонними формами при зміні рівноважної концентрації ліганду, встановлює області існування: своб. іонів (I); координаційно ненасичених форм (II); координаційно насичених комплексних іонів (III).

Склад комплексних іонів можна визначати дек. прийомами: за емпі-річ. залежності між рухливістю іонів і величиною їх заряду; зі співвідношення загальної і рівноважної концентрацій ліганду, доорої визначається за швидкістю електроміграціі введеного в систему допоміжні. металу (по ур-нію 2); за співвідношенням між коеф. дифузії і рухливістю при одній і тій же концентрації ліганду.

Константи стійкості іонних форм розраховують шляхом вирішення системи з п ур-ний виду (2), де п дорівнює числу іонних форм.

Лекція 18. Методи мічених атомів

ІЗОТОПНІ ІНДИКАТОРИ, в-ва, які мають у своєму складі хім. елемент з ізотопним складом, що відрізняється від природного. Часто І. і. називають самі ізотопи-мітки, що додаються в в-во, що містить прир. суміш ізотопів даного елементу. Тому поведінка ізотопів одного елемента в фіз. - Хім. процесах практично ідентично (за винятком легких елементів з атомними номерами Z = 10-12, для яких відносно велику роль можуть грати ізотопні ефекти), використання І. і. дозволяє з реєстрації ізотопу-мітки досліджувати самодифузії та міграцію міченого в-ва, визначати мізерно малі кол-ва в-ва, вивчати механізми хім. р-ций і біол. процесів (т. зв. метод ізотопних індикаторів, раніше наз. методом мічених атомів) Лекція 19. Спектрофотометричні методи аналізу

Спектрофотометр, метод дослідження та аналізу в-в, заснований на вимірюванні спектрів поглинання в оптич. області електромагніт. випромінювання. Іноді під С. розуміють розділ фізики, який об'єднує спектроскопію (як науку про спектрах електромагніт. Випромінювання), фотометрію і спектрометрію [як теорію і практику вимірювання соотв. інтенсивності та довжини хвилі (або частоти) електромагніт. випромінювання]; на практиці С. часто ототожнюють з оптич. спектроскопією. За типами досліджуваних систем С. зазвичай ділять на молекулярну й атомну. Розрізняють С. в ІК, видимій та УФ областях спектру (див. Інфрачервона спектроскопія, Ультрафіолетова спектроскопія).

Застосування С. в УФ і видимій областях спектру засноване на поглинанні електромагніт. випромінювання сполуками, що містять хромофорні (напр., С = С, С = С, С = О) і ауксохромние (ОСН3, ОН, NH2і ін.) групи (див. Кольоровість органічних сполук}. Поглинання випромінювання в цих областях пов'язано з порушенням електронів s-, p-і n-орбіталей осн. стану і переходами молекул в порушені стану: s: s *, n: s *, p: p * і n: p * (переходи перераховані в порядку зменшення енергії, необхідної для їх здійснення ; див. також Молекулярні спектри). Переходи s: s * знаходяться в далекій УФ області, напр. у парафінів при ~ 120 нм. Переходи n: s * спостерігаються в УФ області; напр., орг. соед., що містять n-електрони , локалізовані на орбіталях атомів О, N, Hal, S, мають Смуги поглинання при довжині хвилі бл. 200 нм. Лінії, відповідні переходам p: p *, напр., у спектрах гетероцікліч. з'єднань проявляються в області ок.250-300 нм і мають велику інтенсивність. Смуги поглинання, відповідні переходам n: p *, знаходяться в ближній УФ і видимій областях спектра; вони характерні для соед., в молекулах яких брало є такі хромофорні групи, як С = О, C = S, N = N. Так, насичений. альдегіди і кетони мають максимуми поглинання при довжині хвилі ок.285 нм. Переходи типу n: p * часто виявляються забороненими, і відповідні смуги поглинання володіють дуже малою інтенсивністю.

Переходи типу p: p * можуть супроводжуватися переходом електрона з орбіталі, локалізованої гл. обр. на одній групі (напр., С = С), на орбіталь, локалізовану на ін. групі (напр., С = О). Такі переходи супроводжуються перенесенням електрона з одного атома на інший і відповідні спектри зв. спектрами з переносом заряду. Останні характерні для разл. комплексів (напр., арома-тич. сполук з галогенами), інтенсивно поглинають у видимій і УФ областях.

Для іонів перехідних металів та їх комплексних соед. характерні переходи за участю d-електронів, а для РЗЕ і актиноїдів-переходи з участю f-електронів. Відповідні соед. в р-ре бувають інтенсивно пофарбованими, причому фарбування (спектр поглинання) залежить від ступеня окислення катіона і стійкості комплексної сполуки. Тому С. широко використовують при дослідженні та аналізі комплексних соед. металів.

Ізольовані, що не взаємодіють між собою хромофори в молекулі поглинають незалежно. У разі к. - Л. взаємодій. між ними аддитивность спектрів порушується. За відхиленнями від адитивності можна судити про характер і величиною взаємодії. Оскільки положення смуг в спектрі визначається як різниця енергій основного і збудженого станів молекул, можна визначати структуру енергетичних. рівнів молекул або за відомою схемою енергетичних. рівнів визначати положення смуг поглинання. Будь-якому електронному стану молекул відповідає набір разл. колебат. рівнів енергії. Колебат. структура смуги, відповідної переходу між електронними рівнями, може чітко виявлятися не тільки в спектрах газів, а й у спектрах нек-яких розчинів, що дає можливість отримувати доповнить. інформацію про взаємодій. молекул. Спектрофотометрич. дослідження спектрів молекул у видимій і УФ областях дозволяє встановити вид електронних переходів і структуру молекул. При цьому часто досліджують вплив разл. типів заміщення в молекулах, зміни р-телеглядачам, т-ри та ін. фіз. - Хім. факторів.

В ІК області проявляються переходи між колебат. і вращат. рівнями (див. Коливальні спектри, Обертальні спектри). Серед частот коливань молекул виділяють т. Зв. характеристичні, к-які практично постійні за величиною і завжди проявляються в спектрах хім. соед., що містять певні функц. групи (внаслідок чого ці частоти іноді називають груповими; див. табл. на форзаці 2-го тому). Теорія коливань складних молекул дозволяє розрахунковим шляхом передбачити колебат. спектр сполук, тобто визначити частоти та інтенсивності смуг поглинання.

Колебат. спектри молекул чутливі не тільки до зміни складу і структури (тобто симетрії) молекул, але і до зміни разл. фіз. і хім. факторів, напр. зміні агрегатного стану в-ва, т-ри, природи р-розчинника, концентрації досліджуваного в-ва в розчині, разл. взаємодій. між молекулами в-ва (асоціація, полімеризація, освіта водневого зв'язку, комплексних соед., адсорбція і т.п.). Тому ІК спектри широко використовують для дослідження, якостей. і кількостей. аналізу різноманітних в-в.

У ближній ІЧ області (10000-4000 см-1, або 1-2,5 мкм), де розташовані обертони і складові частоти осн. коливань молекул, смуги поглинання мають інтенсивність в 102-103раз менше, ніж в середній ІЧ області (4000-200 см-1). Це спрощує підготовку зразків, т.к товщина поглинаючого шару м. Б. досить великий (до дек. мм і більше). Експери. техніка для роботи в цій області відносно проста. Однак чутливість і селективність визначення окремих соед. невеликі. Проте високе відношення сигнал: шум (до 105) створює хороші умови для кількостей. аналізу при вмісті визначається соед. ок.1% і вище. Подібні аналізи виконуються за 1 хв. У далекій ІЧ області (200-5 см-1) можуть спостерігатися чисто вращат переходи.

Інтенсивність смуги поглинання молекули визначається ймовірністю відповідного електронного (або коливального) переходу. Для характеристики інтенсивності смуги служить молярний коеф. поглинання e (див. Спектр поглинання), який визначається, відповідно до закону Бугера-Ламберта-Бера, як e = A / Cl, де А = = - lgT = - lg (I / I0), T-пропускання, I0і I-інтенсивності соотв . падаючого і пройшов через в-во випромінювання, С-молярна концентрація в-ва, що поглинає випромінювання, l-товщина поглинаючого шару (кювети), в см. Зазвичай e <105, в ІЧ області e <2 · 103 (л / моль · см). Закон Бугера-Ламберта-Бера лежить в основі кількостей. аналізу за спектрами поглинання.

Для вимірювання спектрів використовують спектральні прилади-спектрофотометри, осн. частини догрого: джерело випромінювання, диспергирующий елемент, кювета з досліджуваним в-вом, реєструючий пристрій. В якості джерел випромінювання застосовують дейтерієву (або водневу) лампу (в УФ області) та вольфрамову лампу розжарювання або галогенну лампу (у видимій та ближній ІЧ областях). Приймачами випромінювання служать фотоелектронні помножувачі (ФЕУ) і фотоелементи (фоторезистори на основі PbS). Диспергуючими елементами приладу є призму-ний монохроматор або монохроматор з дифракції. решітками. Спектр отримують в графич. формі, а в приладах з вбудованою міні-ЕОМ-в графічній та цифровій формах. Графічно спектр реєструють в координатах: довжина хвилі (нм) і (або) хвильове число (див-1) - пропускання (%) і (або) оптич. щільність. Осн. характеристики спектрофотометрів: точність визначення довжини хвилі випромінювання і величини пропускання, роздільна здатність і світлосила, час сканування спектра. Міні-ЕОМ (або мікропроцесори) здійснюють автоматизир. управління приладом і разл. мат. обробку одержуваних експери. даних: статистич. обробку результатів вимірювань, логарифмирование величини пропускання, багаторазове диференціювання спектру, інтегрування спектра по разл. програмами, поділ перекриваються смуг, розрахунок концентрацій окремих компонентів і т.п. Спектрофотометри зазвичай забезпечуються набором приставок для отримання спектрів відбиття, роботи зі зразками при низьких і високих т-рах, для вимірювання характеристик джерел і приймачів випромінювання і т.п.

Для дослідження спектрів в ІК області використовують зазвичай спектрофотометри, що працюють в інтервалі від 1,0 до 50 мкм (від 10000 до 200 см-1). Осн. джерелами випромінювання в них є стрижень з кароіда кремнію (глобар), штифт із суміші оксидів цирконію, торію та ітрію (штифт Нернста) і спіраль з ніхрому. Приймачами випромінювання служать термопари (термоелементи), болометри, разл. моделі оптико-акустич. приладів і піроелектріч. детектори, напр. на основі дейтерированного триглицинсульфата (ТГС). У спектрофотометрах, сконструйованих по "клас-сич." схемою, як диспергирующих елементів застосовують призменний монохроматор або монохроматор з дифракції. решітками. З кон.60-х гг.20 в. випускаються ІК Фур'є-спектрофотометри (див. Фур'є-спектроскопія), к-які володіють унікальними характеристиками: роздільна здатність-до 0,001 см-1, точність визначення хвильового числа v-до 10-4см-1 (відносить. точність bDv / v !! 10 -8), час сканування спектра може досягати 1 с, відношення сигнал: шум перевищує 105. Ці прилади дозволяють вивчати зразки масою менше 1 нг. До них також є разл. приставки для отримання спектрів відбиття, дослідження газів при малих або високих тисках, різних т-рах і т.п. Вбудована в прилад міні-ЕОМ управляє приладом, виконує Фур'є-перетворення, здійснює накопичення спектрів, проводить разл. обробку одержуваної інформаціі.Лекція 20. Флюоріметріческіе методи аналізу

Наиб. поширення набув аналіз, заснований на фотолюмінесценції досліджуваного в-ва, порушуємо УФ випромінюванням. Джерелами останнього служать кварцові газорозрядні ртутні або ксенонові лампи і УФ лазери. Pегістріруют люмінесценцію візуально, фотографічно або фотоелектричні за допомогою спектрографов, фотометров і спектрофотометрів Л. а. підрозділяють на якісний і кількісний. Якостей Л. а. проводять за спектрами люмінесценції. Його використовують, напр., Для виявлення бітумів в породах, слідів люминесцирующих орг. і неорг. в-в в разл. об'єктах. Різновид якостей. Л. а. - Сортовий аналіз, к-рий дозволяє виявляти невидимі при звичайному освітленні відмінності в досліджуваних об'єктах і використовується для встановлення сортності та якості стекол, насіння, с. - Х. продукції, для визначення мінералів в породах, поверхневих і наскрізних дефектів, виявлення підробок, в криміналістиці і т.д. Кількостей Л. а. заснований на залежності інтенсивності люмінесценції від кол-ва люмінесцирующего в-ва. Розрізняють флуоресцентний, фосфоресцентних і хемілюмінесцентний аналізи. Флуоресцентний аналіз заснований на утворенні люминесцирующих комплексних соед. елементів з орг. реагентами, напр. гідроксипохідних флавона (морін, кверцетин), похідними трігідроксіфлуорона і гідроксіантрахінона, 8-оксихинолином, родаміном та ін. Цей метод мало селективний, більшість реагентів - групові, лише люмогалліон специфічний для визначення Ga і люмомагнезон - Mg. Для збільшення селективності використовують екстракційно-флуоресцентний аналіз - передуватиме. поділ аналізованої суміші методом екстракції, а також охолодження розчинів до азотних і гелієвих т-р. В останньому випадку може виникнути фосфоресценція. Фосфоресцентних аналіз має велику селективність, т.к лише деякі катіони утворюють з орг. реагентами фосфоресціюючі комплекси, самі ж реагенти НЕ фосфоресціруют.д.ля реєстрації спектрів та інтенсивності фосфоресценції використовують фосфороскоп; при цьому флуоресценція не реєструється. Хемілюмінесцентний аналіз заснований на світінні, що виникає в результаті окислить. - Відновить. р-ций орг. в-в, напр. люминола, люцигенина та ін., з катіонами перехідних металів, напр. Fe (III), Co (II), Cu (II), Ni (II), Mn (II) та ін .; концентрацію останніх визначають по зміні інтенсивності світіння. Межа виявлення 5.10-7%. За власною люмінесценції визначають U, лантаноїди та деякі перехідні елементи з великою селективністю, т.к їх спектри в ряді випадків характеризуються структурою. Межі виявлення U у водах і геол. об'єктах при застосуванні крісталлофосфоров 5.10-7 -1.10-8%; РЗЕ при використанні орг. реагентів 103 -10-4%, в крісталлофосфоров 10-5-10-6%; перехідних елементів (в т. ч. і платинових) в крісталлофосфоров 10-5-10-6%. Ртутеподобние іони (Tl +, Pb2 +, Bi3 +, Те4 +, As3 +, Sb3 +) можна визначати по люмінесценції заморожених розчинів їх солей або в крісталлофосфоров з межею виявлення 10-4-10-7%. Застосування лазерів дозволяє знизити межі виявлення нек-яких елементів до 10-13% .л. а. орг. соед. утруднений, т.к їх спектри люмінесценції, як правило, неспецифічні. Однак запропоновані методи кількостей. визначення порфіринів, вітамінів, антибіотиків, хлорофілу та ін. в-в, у спектрах яких брало є характеристичностью смуги. При використанні лазерів межі виявлення досягають 10-7-10-11%. Ароматіч. соед. в заморожених розчинах аліфатіч. вуглеводнів при т-рах 77 К дають характерні для кожного соед. квазілінейчатие спектри люмінесценції (ефект Шпольського). Цей метод використовують для визначення поліцікліч. ароматич. вуглеводнів в екстрактах рослин, грунтів, продуктів харчування, гірських порід і т.д. з межею виявлення 10-7-10-8%, а також для визначення бензолу, його гомологів і похідних, ароматич. амінокислот при т-рах рідкого повітря, азоту, гелію в водно-сольовий матриці з межею виявлення 10-4-10-6% .л. а. використовують в іммунохім. аналізі для визначення антитіл, гормонів, лек. препаратів, вірусних і бактеріальних антигенів по концентрації комплексу антиген - антитіло. При цьому в імунній флуоресцентному аналізі до антитіла безпосередньо приєднують флуоресцирующие в-ва, напр. РЗЕ, флуоресцирующие барвники (чутливість методу 10-14моль / л), а в імуноферментного аналізу до антитіла приєднують фермент і в результаті ферментативної р-ції, супроводжуваної біолюмінесценцією, визначають ферментативну активність.

Лекція 21. Імуноферментний аналіз

Лекція 22. Радіометричний аналіз. Мас-спектроскопія

Метод аналізу в-ва шляхом визначення маси (частіше, відносини маси до заряду m / z) і відносить. кол-ва іонів, одержуваних при іонізації досліджуваного в-ва або вже присутніх у досліджуваній суміші. Сукупність значень m / z і відносить. величин струмів цих іонів, представлена ??у вигляді графіка або таблиці, наз. мас-спектром в-ва (рис.1).

Початок розвитку М. - с. покладено дослідами Дж. Томсона (1910), що досліджував пучки заряджених частинок, поділ яких брало по масам проводилося за допомогою елект. і магн. полів, а спектр реєструвався на фотопластинки. Перший мас-спектрометр побудований А. Демпстера в 1918, а перший мас-спектрограф створив Ф. Астон в 1919; він же досліджував ізотопіч. складу великого числа елементів. Перший серійний мас-спектрометр створений А. Ніром в 1940; його роботи поклали початок изотопной М. - с. Пряме з'єднання мас-спектрометра з газо-рідинним хроматографом (1959) дало можливість аналізувати складні суміші летких соед., А з'єднання з рідинним хроматографом за допомогою термораспиліт. пристрої (1983) - суміші важколетких з'єднань. Macс-спектральні прилади. Для поділу іонів досліджуваного в-ва по величинам m / z, вимірювання цих величин і струмів розділених іонів використовують мас-спектральні прилади. Прилади, в яких брало реєстрація здійснюється електричні. методами, наз. мас-спектрометрами, а прилади з реєстрацією іонів на фотопластинках - мас-спектрографами. Мас-спектральні прилади складаються з системи введення проби (система напуску), іонного джерела, розділового пристрою (мас-аналізатора), детектора (приймача іонів), вакуумних насосів, які забезпечують досить глибокий вакуум у всій вакуумній системі приладу, і системи управління та обробки даних (рис.2). Іноді прилади з'єднують з ЕОМ:

Мас-спектральні прилади характеризуються чутливістю, до-раю визначається як відношення числа зареєстрованих іонів до числа атомів введеної проби. За абс. поріг чутливості приймають мінім. кол-во досліджуваного в-ва (виражене в г, молях), за відносний - мінім. масову або об'ємну частку в-ва (виражену в%), к-які забезпечують реєстрацію вихідного сигналу при відношенні сигнал-шум 1: 1. Іонний джерело призначений для утворення газоподібних іонів досліджуваного в-ва і формування іонного пучка, к-рий направляється далі в мас-аналізатор. наиб. універсальний метод іонізації в-ва - електронний удар. Вперше здійснено П. Ленард (1902). Суч. джерела такого типу побудовані за принципом джерела А. Нира (рис.3).

Рис.3. Схема іонного джерела типу джерела А. Нира: 1 - постійний магніт; 2 - катод; 3 - виштовхує електрод; 4 - потік електронів; 5 - пастка електронів; 6 - іонний промінь; 7 - введення в-ва.

Для іонізації молекул зазвичай використовують електрони з енергіями 70-100 еВ, к-які рухаються зі швидкістю 108см / с і проходять шлях, рівний діаметру молекули орг. соед. за 10?16с. Цього часу достатньо для видалення електрона з молекули в-ва і освіти мовляв. іона - позитивно зарядженого іон-радикалу М + ', що має енергію 2-8 еВ. Іони з мінім. запасом енергії досить стійкі і досягають приймача. Іони з великим запасом внутр. енергії розпадаються на шляху руху на іони з меншою мовляв. масою (т. зв. осколкові іони), характерні для в-ва певного будови. Для іонізації молекул енергія електронного пучка повинна перевищувати нек-рую критичну для в-ва величину, наз. потенціалом іонізації. Потенціали іонізації лежать в межах 3,98 еВ (Fr) - 24,58 еВ (Не), для більшості орг. соед.7-11 еВ. Використовуючи моноенергетіч. пучки електронів і знижуючи їх енергію до порогових значень, можна визначати потенціали іонізації в-в і потенціали появи іонів - критич. енергію електронів, при до-рій в спектрі з'являються лінії відповідних осколкових іонів. При іонізації електронним ударом відбувається перерозподіл енергії збудження по колебат. ступеням свободи мовляв. іона, перш ніж цей іон розпадається. Припущення про квазірівноважному розподілі енергії збудження дозволяє полуемпіріч. шляхом розрахувати мас-спектри нек-яких в-в, узгоджувалися з експери. даними. Однак у мн. випадках, особливо для довгих молекул, ця теорія не підтверджується. Для двохатомних молекул зміни колебат. станів пояснюються, виходячи з принципу Франка - Кондона (див. Квантові переходи). При взаємодій. нізкоенсргетіч. електронів (менше 10 еВ) з в-вом можуть здійснюватися процеси резонансного захоплення електронів молекулами з утворенням негативно заряджених іонів М? (див. також Іони в газах). М. - С. електронного удару - високочувствіт. метод аналізу, дозволяє аналізувати пікомольние кол-ва в-ва, її воліють для дослідження структури з'єднань. Існують "бібліотеки" мас-спектрів, що містять спектри більше 70000 орг. соед., по яких можна проводити їх ідентифікацію з застосуванням ЕОМ. Недоліки методу: мол. іони утворюються лищь у 20% орг. соед .; метод застосовується лише для визначення легколетких термічно стабільних соед .; в значеннях повного іонного струму на іони з великими значеннями m / z, що дають інформацію про мовляв. масі і наявності функц. груп, доводиться менша частина; негативно заряджені іони, що мають велике значення в структурному аналізі, утворюються в дуже невеликій кількості і обмеженим числом орг. сполук. Хім. іонізація здійснюється при зіткненні молекул досліджуваного в-ва з іонами реагентного газу, як до-якого м. б. індивідуальні в-ва або їх суміші. Реагентний газ знаходиться в джерелі під тиском 65-130 Па, парціальний тиск досліджуваного в-ва 0,1-0,01 Па. При бомбардуванні такої суміші електронами з енергією 70-500 еВ переважно. іонізуються молекули реагентного газу; утворилися позитивно заряджені іони в результаті іонно-молекулярних зіткнень з неіонізованій молекулами реагентного газу перетворюються в реактантние іони, к-які в свою чергу взаємодій. з молекулами досліджуваного в-ва і іонізують їх, утворюючи іони МН.

Хім. іонізація з утворенням позитивно заряджених іонів може здійснюватися також в результаті переносу заряду з реактантних іонів, напр., не + ', Ar +', N2 + ', СО +', NO + 'на молекули досліджуваного в-ва; при цьому утворюється мовляв. іон М +. Мас-спектри хім. іонізації з реагентними газами Ar і N2напомінают спектри електронного удару. Метод хім. іонізації дозволяє оцінювати кислотно-основні св-ва орг. соед. в газовій фазі. Хім. іонізація з утворенням негативно заряджених іонів здійснюється в результаті взаємодій. досліджуваних молекул з іонами NH2?, ОН?, СН3О? (спорідненість до протону соотв.1682, 816 і 778 кДж / моль). Останні утворюються при захопленні молекулами NH3, H2O і СН3ВІН електронів з пониж. енергією (ок.6 еВ) з послід. розпадом утворилися мовляв. іонів М? (дисоціативний захват). Іони ОН?і СН3О?образуются в означає. кол-ве при електронній бомбардуванні соотв. сумішей N2O з СН4ілі (СН3) 3СН, Н2О і N2O з СН3ВІН. Часто метод хім. іонізації більш чутливий, ніж метод іонізації електронним ударом, т.к практично всі наявні в іонізаційній камері електрони використовуються для іонізації. Метод дозволяє аналізувати просторів. і оптич. ізомери. Його важлива перевага - великий вихід протоновані мовляв. іонів МН + при малому виході осколкових іонів. Польова іонізація здійснюється в сильному електричні. поле, що утворюється в просторі між польовим анодом (вістря або тонка вольфрамова дріт) і протівоелектродом (катодом), різниця потенціалів між якими 10 кВ. Молекула в такому електричні. поле втрачає електрон і перетворюється. в позитивно заряджений іон. Мас-спектри нагадують спектри електронного удару. Польова десорбція. Труднолетучие орг. і неорг. соед. наносяться на пов-сть спеціально обробленого дротяного емітера, поблизу к-якого існує сильне електричні. полі. В результаті тунельного переходу електрона молекули до емітера в-во на пов-сті дроту іонізується; утворилися іони десорбируются і переходять в газоподібний стан. Для полегшення десорбції дріт підігрівають, пропускаючи через неї електричні. струм. Застосовується в аналізі синтетичні. полімерів і вуглеводнів. При фотоіонізації молекули іонізуються в результаті поглинання єдностей. фотона, енергія до-якого повинна перевищувати потенціал іонізації молекули. Джерела фотонів - газосветние лампи, розряди у водні або інертних газах, синхротрони. Багатофотонні іонізація газоподібних в-в відбувається в результаті одночасного поглинання молекулою дек. фотонів. Такі процеси спостерігаються при взаємодій. з в-вом досить інтенсивного пучка лазерного випромінювання, енергія квантів догрого менше потенціалу іонізації. Для цієї мети використовують перебудовувані лазери на барвниках, що утворюють випромінювання з довжинами хвиль 250-700 нм. Для іонізації більшості молекул досить поглинання 2-3 фотонів з енергією 1,77-4,96 еВ. Десорбціонную іонізація заснована на бомбардуванню важколетких в-ва, поміщеного в матрицю (гліцерин, монотіогліцерін, поліетиленгліколі, етаноламіни та ін. Рідини), пучками прискорених частинок (атоми або іони інертних газів Ar, Кr, Хе, а також іони лужних металів, напр. Cs). В результаті дифузійного обміну в рідині з опромінюваної пов-сті безперервно видаляються продукти деструкції в-ва, що дозволяє отримувати добре відтворювані мас-спектри. Застосовують також метод іонізації важкими продуктами поділу радіоактівного252Cf та іонами важких елементів, одержуваними на прискорювачах. У місцях потрапляння таких важких частинок в мішень, до-раю являє собою плівку досліджуваного в-ва на металеві. фользі, металлизируются. пластиці або нітроцелюлозі, за 10?11с досягаються т-ри до 3.104 ° С. Таке швидке нагрівання дозволяє іонізувати важкі молекули без розкладання. Лазерна десорбція застосовується для іонізації і випаровування конденсуються. в-в і здійснюється за допомогою лазерів з модульованим добротністю, що працюють в імпульсному (тривалістю до 30 нс) або безперервному режимах. Характер мас-спектра зазвичай мало залежить від довжини хвилі (265 нм - 10,6 мкм), уд. потужності (103-1010Вт / см2) і тривалості імпульсу лазерного випромінювання. Досліджуване в-во наносять на металеві. підкладку і опромінюють фотонами з будь-якого боку залежно від конструкції приладу. Використання лазерних променів різного ступеня сфокусированности дозволяє проводити локальний аналіз проби в плямі діаметром 0,5 мкм - 4 мм. Можлива іонізація в-ва в искровом або тліючому розряді. На електроди, один з яких брало виготовлений з досліджуваного в-ва, подається напруга (не більше 15 кВ) у вигляді коротких імпульсів високої частоти. Пробій між електродами призводить до випаровування матеріалу електродів і його іонізації в утворюється плазмі. Утворилися позитивно заряджені іони, прискорюючись у бік катода, до-рим служить досліджуване в-во, бомбардують його пов-сть і розпилюють зразок. Розпорошені частки, проходячи крізь розряд, іонізуються. Для елементного та ізотопного аналізів знаходять застосування іонні джерела з іонізацією зразка в індуктивно-плазмі Ar при атм. тиску. Поверхнева іонізація - осн. метод в изотопной М. - с. В-во наноситься на пов-сть стрічки з Re, W або Та, до-раю нагрівається до 2000-2500 К. Якщо потенціал іонізації в-ва менше роботи виходу електрона з металу стрічки, то частина молекул або атомів покидає її пов-сть в іонізують. стані. У нек-яких випадках молекула може захоплювати електрон з металу і утворювати негативно заряджені іони.

Мас-аналізатори - пристрої для просторів. або тимчасового розділення іонів з разл. значеннями m / z в магн. або електричні. полях або їх комбінаціях. Розрізняють статичний. і динамич. аналізатори. У статичних іони розділяються в постійних або практично незмінних за час їх руху через аналізатор магн. полях. Іони з разл. значеннями m / z рухаються в такому аналізаторі по різних траєкторіях і фокусуються або в різних місцях фотопластинки, або послідовно на щілину детектора в результаті плавної зміни напруженості електричні. і магн. полів аналізатора. У динамич. анализаторах поділ іонів відбувається під впливом імпульсних або радіочастотних електричні. полів з періодом зміни меншим або рівним часу прольоту іонів через мас-аналізатор. Іони з разл. значеннями m / z, як правило, поділяються за часом прольоту певної відстані. Тиск в аналізаторах має бути достатньо низьким (~ 10?5Па), щоб уникнути розсіювання іонів на молекулах залишкових газів. Осн. характеристика мас-аналізатора - його роздільна здатність, або роздільна сила R. Вона характеризує здатність аналізатора розділяти іони з незначно відрізняються один від одного масами і визначається відношенням значення маси іона М до ширини його піку DМ (вираженої в атомних одиницях маси) на певному рівні висоти піка (зазвичай 50 або 10%): R = М / DМ. Напр., R = 10000 означає, що мас-аналізатор може розділяти іони з масами 100,00 і 100,01. Hаіб. часто застосовують статистичні мас-аналізатори з однорідним магнітним полем (одинарна фокусування) або комбінацією електричні. і магн. полів (подвійна фокусування). У мас-аналізаторах з одинарною фокусуванням (рис.4) іонний промінь, сформований в джерелі іонів, виходить з щілини шириною S1в вигляді розходиться іонного пучка і в магн. поле розділяється на пучки іонів з разл. значеннями m / z.

Рис.4. Схема мас-аналізатора з однорідним магн. полем: S1і S2 -щелі джерела і детектора іонів; ОAВ - область однорідного магн. поля Н, перпендикулярного площині малюнка; тонкі суцільні лінії - межі пучків іонів з різними т / z; r - радіус центр. траєкторії іонів.

Під дією поля, силові лінії яких брало спрямовані перпендикулярно напрямку руху іонного пучка, іони рухаються по круговій траєкторії з радіусом r = (2Vmn / zH2) 1/2, де V - напруга, що прискорює іони, mn- маса іона, z - заряд іона, H - напруженість магн. поля. Іони з однаковою кинетич.

енергією, але з різними масами або зарядами проходять через аналізатор по разл. траєкторіями. Зазвичай розгортка мас-спектра (реєстрація іонів з певними значеннями m / z) здійснюється зміною Н при постійному V. Розкид іонів, що вилітають з іонного джерела, за кинетич. енергій, а також недосконалість фокусування за напрямками призводять до розширення іонного пучка, що позначається на роздільної здатності. Для статич. мас-аналізатора R = r / (S1 + S2 + d), де S1і S2 -соотв. ширина вхідний і вихідний щілин, d - уширение пучка в площині вихідний щілини. Зменшення розміру щілин для збільшення роздільної здатності приладу важко здійсненне технічно і, крім того, призводить до дуже малим іонним струмам, тому зазвичай конструюють прилади з великим радіусом траєкторії іонів (r = 200 - 300 мм). Роздільна здатність м. Б. підвищена також при використанні мас-аналізаторів з подвійним фокусуванням. В таких приладах іонний пучок пропускають спочатку через отклоняющее електричні. поле спец. форми, в к-ром здійснюється фокусування пучка по енергіях, а потім через магн. полі, в к-ром іони фокусуються за напрямами (рис.5).

Рис.5. Схема мас-аналізатора з подвійним фокусуванням: S1і S2 -щелі джерела і детектора іонів; 1 - конденсатор; 2 - магніт.

Існує більше 10 типів динамич. мас-аналізаторів: квадрупол'ний, час-пролітний, циклотронно-резонансний, магнітно-резонансний, радіочастотний, фарвітрон, омегатрон та ін. Нижче розглянуті наиб. широко застосовуються мас-аналізатори. Квадрупольний мас-аналізатор являє собою квадрупол'ний конденсатор (Рис.6), до пар паралельних стрижнів догрого прикладені постійна напруга V і змінне високочастотне V0cos wt (w? - частота, t - час); їх суми для кожної пари рівні за величиною і протилежні за знаком.

Рис.6. Схема квадрупольного мас-аналізатора: 1 - високочастотний генератор; 2 - генератор постійної напруги; 3 - генератор розгортки; 4 і 5 - джерело і детектор іонів.

Іони, що вилетіли з іонного джерела, рухаються в камері аналізатора уздовж осі z, паралельної поздовжніх осях стрижнів, по складних об'ємним спіралевидним траєкторіях, здійснюючи поперечні коливання уздовж осей x і у. При фіксованих значеннях частоти і амплітуди змінної напруги іони з певними значеннями m / z проходять через квадрупол'ний конденсатор, у іонів з ін. Значеннями m / z амплітуда поперечних коливань досягає такої величини, що вони вдаряються об стрижні і розряджаються на них. Розгортка мас-спектра проводиться шляхом зміни постійного і змінного напрузі або частоти. Для суч. квадрупольних мас-спектрометрів R = 8000. Перший квадрупольний прилад побудований В. Паулі і X. Штайнведелем (ФРН, 1953). Час-пролітний мас-аналізатор являє собою еквіпотенційне простір, в якому дрейфують іони, розділяючись за швидкостями руху (рис.7). Іони, що утворюються в іонному джерелі, дуже коротким електричні. імпульсом "впорскуються" у вигляді "іонного пакету" через сітку в аналізатор. У процесі руху вихідний іонний пакет розшаровується на пакети, що складаються з іонів з однаковими значеннями m / z. Швидкість дрейфу відшарувалися іонних пакетів і, отже, час їх прольоту через аналізатор довжиною L обчислюється за ф-ле: (V - напруга). Сукупність таких пакетів, що надходять в детектор, утворює мас-спектр. Для суч. приладів R = 5000 - 10000. Перший прилад створений А. Камероном і Д. Егтерсом (США, 1948), а в СРСР - Н.І. Іоновим (1956).

Рис.7. Схема час-пролітної мас-аналізатора: 1 - сітка; 2 - детектор.

Мол. іон пептиду розпадається в результаті розриву зв'язків СН-СО, СО-NH, NH-СН і СН-R з утворенням осколкових іонів соотв. Аnі Хn, Вnі Yn, Сnі Zn, Snі Rn (n - номер амінокислотного залишку в пептидного ланцюга), к-які далі розпадаються таким же чином. Загальне у піків іонів в такому спектрі може досягати дек. сотень. Кількість фрагментів визначається будовою досліджуваної молекули, запасом внутр. енергії мовляв. і осколкових іонів і проміжком часу між освітою іона і його детектированием. Тому при інтерпретації мас-спектрів необхідно враховувати як умови вимірювань (енергію іонізуючих електронів, прискорює напруга, тиск парів в іонному джерелі, т-ру іонізації. Камери), так і конструктивні особливості приладу. При макс. стандартизації умов вимірювань вдається отримувати достатньо відтворювані мас-спектри. Порівняння мас-спектра досліджуваної системи зі спектром, наявними в каталозі, - наиб. швидкий і простий спосіб структурного аналізу, ідентифікації в-в при визначенні забруднення навколишнього середовища, контролі продуктів харчування людини і тварин, вивченні процесів метаболізму лек. препаратів, в криміналістиці і т.д. Однак ідентифікація лише на підставі мас-спектра не може бути однозначною, напр. не всі ізомерні в-ва утворюють розрізняються мас-спектри. В умовах М. - с. частина порушених іонів розпадається після виходу з іонного джерела. Такі іони зв. метастабільними. У мас-спектрах вони характеризуються розширеними піками при нецілочисельне значеннях т / z. Один з методів вивчення таких іонів - спектроскопія мас і кинетич. енергій іонів. Вивчення розпаду метастабільних іонів проводять на приладах, у яких брало магн. аналізатор передує електричному. Магн. аналізатор налаштовують таким чином, щоб він пропустив метастабільний іон, к-рий при певній напрузі на електричні. аналізаторі проходить в детектор. Якщо такий іон розпадається в просторі між аналізаторами, то утворюються вторинні іони не можуть пройти через електричні. аналізатор при встановленому напрузі через нестачу енергії. Для попадання вторинних іонів в детектор змінюють напругу електричні. аналізатора. Ця напруга пов'язано з масою вторинного іона співвідношенням m2 = Е2m * / Е0, де m * - метастабільний іон, m2- вторинний іон, Е0і Е2 -початковий і кінцева напруга електричні. аналізатора. Таким чином визначаються маси всіх іонів, що утворюються при розпаді метастабільних іонів і встановлюються тим самим схеми їх фрагментації. Якщо в області між двома аналізаторами створити область підвищ. тиску (встановити камеру зіткнень, заповнену інертним газом), то в результаті зіткнень іонів з молекулами газу їх внутр. енергія буде збільшуватися і, отже, збільшиться ймовірність утворення вторинних іонів. Такий метод, наз. тандемним, використовують для структурного аналізу індивідуальних компонентів складних сумішей без передуватиме. поділу. Поряд зі структурними дослідженнями М. - с. застосовують для кількостей. аналізу орг. в-в. Кількостей. аналіз заснований на визначенні інтенсивностей піків іонів з певним значенням т / z. Його проводять хромато-мас-спектрометричного (див. Хромато-мас-спектрометрія) або в системі прямого введення. Для підвищення точності визначення застосовують внутр. стандарти, в якості яких брало використовують мічені сполуки. або соед. близькі за будовою до досліджуваних, напр. гомологи. В останньому випадку необхідна побудова калібрувальних кривих. Вимірювання вмісту досліджуваного в-ва проводять з урахуванням кол-ва додається стандарту по відношенню площ піків, відповідних визначається в-ву і внутр. стандарту. Похибка методу b7%, межа визначення 0,01 мкг / мл. Кращі результати дає застосування мічених соед .; при цьому відпадає необхідність у побудові калібрувальних кривих. Кількостей. визначення важколетких в-в проводять в системі прямого введення, детектуючи їх по одному або дек. іонів, характерним для досліджуваного з'єднання. У міру плавного підвищення т-ри випарника відбувається випаровування і часткове фракціонування досліджуваних в-В.Т. обр., для кожного в-ва отримують криву випаровування, площа під до-рій прямо пропорційна кол-ву соед., внесеного в мас-спектрометр. Абс. чутливість методу, наз. методом інтегрування іонного струму, 10?7г. Гідність методу - відсутність необхідності передуватиме. очищення досліджуваних в-в. При дослідженні соед. з електрофор. угрупованнями, ізомерних орг. молекул, полімерів, азокрасителей, біологічно активних в-в застосовують М. - с. негативно заряджених іонів. Ці іони мають меншим запасом внутр. енергії, ніж позитивно заряджені іони, тому в мас-спектрах дають інтенсивні піки мовляв. іонів і мале кол-во осколкових іонов.Лекція 23. блоттинга-аналіз

Розробка гібридизаційного методу Саузерну. Фундаментальні відкриття, що лежать в основі гібридизаційного методу. Перенесення та ідентифікація макромолекул після поділу. Поняття "блоттинга". Лабораторні модифікації блот-методу для визначення ДНК, РНК і білків. Метод in situ гібридизації, що лежить в основі гістохімічних та цитохімічних методів. FISH - флюоресцентная ідентифікація гібрідізоваться молекул.

Два варіанти приладового та лабораторного виконання методу полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР).

Сучасні тенденції в розробці обладнання для біохімічних лабораторій - переваги і недоліки.

Авіація і космонавтика
Автоматизація та управління
Архітектура
Астрологія
Астрономія
Банківська справа
Безпека життєдіяльності
Біографії
Біологія
Біологія і хімія
Біржова справа
Ботаніка та сільське господарство
Валютні відносини
Ветеринарія
Військова кафедра
Географія
Геодезія
Геологія
Діловодство
Гроші та кредит
Природознавство
Журналістика
Зарубіжна література
Зоологія
Видавнича справа та поліграфія
Інвестиції
Інформатика
Історія
Історія техніки
Комунікації і зв'язок
Косметологія
Короткий зміст творів
Криміналістика
Кримінологія
Криптологія
Кулінарія
Культура і мистецтво
Культурологія
Логіка
Логістика
Маркетинг
Математика
Медицина, здоров'я
Медичні науки
Менеджмент
Металургія
Музика
Наука і техніка
Нарисна геометрія
Фільми онлайн
Педагогіка
Підприємництво
Промисловість, виробництво
Психологія
Психологія, педагогіка
Радіоелектроніка
Реклама
Релігія і міфологія
Риторика
Різне
Сексологія
Соціологія
Статистика
Страхування
Будівельні науки
Будівництво
Схемотехніка
Теорія організації
Теплотехніка
Технологія
Товарознавство
Транспорт
Туризм
Управління
Керуючі науки
Фізика
Фізкультура і спорт
Філософія
Фінансові науки
Фінанси
Фотографія
Хімія
Цифрові пристрої
Екологія
Економіка
Економіко-математичне моделювання
Економічна географія
Економічна теорія
Етика

8ref.com

© 8ref.com - українські реферати


енциклопедія  бефстроганов  рагу  оселедець  солянка